生物科学专业《生物化学实验B》课程实践教学大纲（理）

课程名称：生物化学实验B

英文名称：general biochemistry experiment

课程编号：2603057                     是否独立设课：是

学分：1.5                  学时：54             开课学期：3

预修课程：无机及分析化学，有机化学。

一、课程简介

生物化学实验课是在学习生物化学理论课的基础上进行的一个实践性环节，本课程的教学任务是让学生运用已学过的知识验证一些结论、结果和现象，及综合运用已学过的理论知识设计实验或进行综合性的实验，巩固和加深对生物化学课程中基本理论知识的理解，训练学生理论知识的运用能力、实验操作技能、实验数据的处理和分析能力。

二、实验报告要求与实验考核方法

实验报告必须包括：①实验目的和原理；②实验仪器和试剂；③实验步骤和结果；④结果讨论。

实验考核方式应根据：①实验操作情况；②实验报告内容；③实验考试进行评分。

评分方法：平时成绩和实验报告占70％，实验考试占30％。

三、实验指导书与主要参考书

陈均辉等合编：《生物化学实验》，科学出版社，第三版

王秀奇等合编：《基础生物化学实验》，高等教育出版社，第二版

萧能庚、余瑞元等合编：《生物化学实验原理和方法》，北京大学

出版社，第二版

四、实验项目一览表

《 生物化学实验B 》课程实验项目一览表

《生物化学实验B》课程实验项目1

一、实验目的

     1．学习蒽酮比色定糖法的原理和方法

2．学习分光光度计的原理和操作方法

二、实验内容

用蒽酮法测定可溶性糖含量

三、实验原理

蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以和游离的己

糖或多糖中的己糖基，戊醛糖及己糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿

色，在620nm处有最大吸收。

蒽酮可与其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当样品中

存有含较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。对于以上特

定的糖类，反应较稳定。

本法多用于测定糖原含量，亦可用于测定葡萄糖含量。

四、实验方法与步骤

1．制作标准曲线：取干试管6支，按下表操作：

每管加入葡萄糖标准液和水后立即混匀，在冰浴中加入蒽酮试剂，同时在沸水浴中加热7分钟，取出迅速冷却至室温。以第一管为参比，迅速测其于各管的吸光度。以含糖量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线

2．样品含糖量测定：吸取1m1无蛋白糖类溶液置试管中，浸于冰浴

中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中煮沸7分钟，取出后自来水

冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的光密度值由标准曲

线查算出样品液的糖含量。

3．计算：

w=(CV/ m)×100%

w：糖的质量分数（%）

C：为标准曲线查出的糖含量mg／m1。

V：为样品稀释后的体积。（m1）

m：为样品的重量。（mg）

五、实验要求

实验内容要求：学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。

及时记录实验中观察到的现象、结果和数据，原始数据必须准确简练、

详尽、清楚。记录时不能夹杂主观因素，在定量实验中观测的数据，

如称量物的重量、滴定管的读数、光密度值等，都应设计一定的表格，

依据仪器的精确度记录有效数字。

实验报告要求：

实验报告应包括下列各项：

（1）报告的题目（要简明确切）；

（2）写报告人及共同测定人员的姓名；

（3）实验目的；

（4）实验原理；

（5）实验仪器和试剂（包括主要仪器的规格、主要试剂的名称）；

（6）实验数据记录（包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格）；

（7）实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算或用文字说明

（8）分析与讨论，要对实验结果作出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏；

（9）回答思考题。

考核评价要求：以出勤、随堂提问、预习情况、实验操作情况和实验报告等为主要考核内容

六、场地、设备与器材

12幢新实验大楼1楼生化实验室

1．试管及试管架

2．吸量管(1ml、5mL)   

3．恒温水浴箱(100℃)

4．制冰机

5．分光光度计

6．滴管

《生物化学实验B》课程实验项目2

一、实验目的

1.学习和掌握用索氏提取器提取脂肪的原理和方法

2.学习和掌握用重量分析法对粗脂肪进行定量测定

3.了解脂肪的一般提取方法

二、实验内容

用索氏提取器提取脂肪并对粗脂肪进行定量测定。

三、实验原理

根据相似相溶原理，脂类物质易溶于有机溶剂中。在索氏提取

器中用有机溶剂对样品中的脂类物质进行提取。因提取的是脂类物质

的混合物，包括脂肪、游离脂酸、固醇及色素等脂溶性物质，称其为

粗脂肪。

四、实验方法与步骤

1.称出小瓶重量：将洗净的索氏提取器小烧瓶用铅笔在磨口处编号，103~105^。C烘2小时，即可达恒重，干燥器冷却，分析天平称重，并记录。

2.用分析天平称取干燥样品2g，用滤纸包扎好，放入浸提管内。

3.回馏：在已称重的小烧瓶内加1/2~1/3体积的石油醚（30-60℃）。连接索氏提取器各部分，加热回馏2~4小时。控制温度，每小时回馏3~5小时较宜。

4.提取完毕后，待石油醚完全流回小烧瓶，卸开抽提管，取出滤纸筒，再回馏一次，以洗净残留在提取器上的脂肪。然后，卸开抽提管，将石油醚蒸发回收。基本蒸尽时，停止加热，取下小烧瓶，用吹风机将瓶内石油醚在通风柜中吹尽，再在烘箱中103~105^。C烘干（约半小时），取出，干燥器内冷却，称重，从瓶的前后重量差可计算脂肪的含量。

5.同上述，用不包样品的滤纸做空白实验。

6.计算：含油量%=油脂重量/试样重量×100

五、实验要求

同上

六、场地、设备与器材

12幢新实验大楼1楼生化实验室

1．索氏提取器（50ml）

2．分析天平

3．烧杯

4．烘箱

5．干燥器

6．恒温水浴锅

7．镊子

8．脱脂滤纸

9．脱脂棉

《生物化学实验B》课程实验项目3

一、实验目的

1．掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和方法

2．学会使用凯氏定氮仪

二、实验内容

用凯氏定氮法测定蛋白质含量

三、实验原理

常用凯氏定氮法测定天然有机物(如蛋白质，核酸及氨基酸等)的含氮量。

含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称之为“消化”。

但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。甘氨酸的消化过程可表示如下：

浓碱可使消化液中的硫酸按分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到—定量，一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的当量数(相当于待测物中氨的当量数)计算出待测物中的总氮量。

四、实验方法与步骤

1．凯氏定氮仪的构造和安装

凯氏定氦仪由蒸汽发生器，反应管及冷凝器三部分组成。

蒸气发生器包括电炉及一个1～2升容积的烧瓶(图中1，2)。蒸气发生器借橡皮管(图中3)与反应管相连。反应管上端有一个玻璃杯(图中4)，样品和碱液可由此加入到反应室(图中5)中，反应室中心有一长玻璃管，其上端通过反应室外层(图中6)与蒸汽发生器相连，下端靠近反应室的底部。反应室外层下端有一开口，上有一皮管夹(见图中7)，由此可放出冷凝水及反应废液。反应产生的氨可通过反应室上端细管及冷凝器(图中8)通到吸收瓶(图中9)中，反应管及冷轻器之间惜磨口(图中10)连接起来，防止漏气。

安装仪器时，先将冷凝器垂直地固定在铁支台上，冷凝器下端不要距离实验台太近，以免放不下吸收瓶。然后将反应管通过磨口连接(图中10)与冷凝器相连，根据仪器本身的角度将反应管固定在另一铁支台上。这一点务须注意，否则容易引起氨的散央及反应室上端弯管折断。然后格蒸汽发生器放在电炉上，并用橡皮管把蒸汽发生器与反应管连接起来，安装完毕后，不得轻易移动，以免仪器损坏。

2．样品处理：

某一固体样品中的含氮量是用100克该物质(干重)中所含氮的克数来表示(％)。因此在定氮前，应先将固体样品中的水份除掉。一般样品烘干的温度都采用105℃，因为非游离的水，都不能在100℃以下烘干。

在称量瓶中称入一定量磨细的样品，然后置于105℃的烘箱内干燥4小时。用柑蜗钳将称量瓶放入干煤器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每千操1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达桓重。若样品为液体(如血清等)，可取一定体积样品直接消化测定。

精确称取0．1克左右的干燥植物组织作为本实验的样品。

3．消化：

取四个100毫升凯氏烧瓶并标号。各加l1颗玻璃珠，在1及2号瓶中各加样品0．1克，催化剂200毫克，浓硫酸5毫升，注意加样品时应直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。在3及4号瓶中各加0．1毫升蒸馏水和与1及2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。每个瓶口放一漏斗，在通风橱内的电炉上消化。

在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO₂白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。消化完毕，等烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10毫升(注意慢加，随加随摇)。冷却后将瓶内容物倾入50毫升的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并入量瓶，用水稀释到刻度，混匀备用。

4．蒸馏：

(1)蒸馏器的洗涤：蒸汽发生器中盛有用几滴硫酸酸化的蒸馏水。关闭皮管夹7，将蒸汽发生器中的水烧开，让蒸汽通过整个仪器。约15分钟后，在冷凝器下端放一个盛有5毫升2％硼酸溶液和1—2滴指示剂混合液的锥形瓶。位置倾斜如图，冷凝器下端应完全浸没在液体中，继续蒸汽洗涤l一2分钟，观察锥形瓶内的溶液是否变色，如不变色则证明蒸馏装置内部已洗涤干净。向下移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约1厘米继续通蒸汽1分钟。最后用水冲洗冷凝管口，然后用手捏紧橡皮管3，由于反应室外层蒸气冷缩，，压力减低，反应室内凝结的水可自动吸出进入6，打开皮夹7，将废水排出。

(2)蒸馏：取50毫升锥形瓶数个，各加5毫升硼酸和1—2滴指示剂，溶液呈紫色，用表面皿复盖备用。

用吸管取10毫升消化液，细心地由蒸馏器小玻坏注入反应室，塞紧玻棒玻塞。将一个合有硼酸和指示剂的锥形瓶放在冷凝器下，使冷凝器下端浸没在液体内。

用量筒取30％的氢氧化钠溶液10毫升放人小玻璃杯(图中4)，轻提棒状玻璃塞使之流人反应室(为了防止冷凝管倒吸，液体流入反应室必须缓慢)。尚未完全流入时，将玻璃塞盖紧，向玻璃杯中加入蒸馏水约5毫升。再轻提玻璃塞，使一半蒸馏水慢慢流入反应室，一半留在玻璃杯中作水封。加热水蒸汽发生器，沸腾后夹紧夹子7开始蒸馏。此时锥形瓶中的酸溶液由紫色变成绿色。自变色时起记时，蒸馏3—5分钟。移动锥形瓶使硼酸液面离开冷授管约1厘米并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外面。继续蒸馏1分钟，移开锥形瓶，用表面皿复盖锥形瓶。

蒸馏完毕后，须将反应室洗涤干净。在小玻璃杯中倒入蒸馏水，待蒸气很足、反应室外壳6温度很高时，一手轻提棒状玻璃塞使冷水流入反应室，同时立即用另一只手捏紧橡皮管3，则6内蒸气冷缩，可将5中残液自动吸出，再用蒸馏水自4倒入5，重复上述操作。如此冲洗几次后，将7打开，将o中废校排出。再继续下一个蒸馏操作。

待样品和空白消化液均蒸馏完毕后，同时进行滴定。

(3)滴定：全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变谈紫色为滴定终点。

五、实验要求

同上

六、场地、设备与器材

12幢新实验大楼1楼生化实验室

1、50ml凯氏烧瓶

2、凯氏定氮蒸馏装置

3、100ml锥形瓶

4、25ml酸式滴定管

5、分析天平

6、烘箱

 7、电炉

8、1000ml蒸馏烧瓶

 9、小玻璃珠

《生物化学实验B》课程实验项目4

一、实验目的

1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式。

2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。

3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法

4．熟悉蛋白质的沉淀反应

5．进一步掌握蛋白质的有关性质

二、实验内容

蛋白质的呈色和沉淀、变性反应

三、实验原理

(一)双缩脲反应：

1.原理：

尿素加热至180℃左右生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与cu²⁺结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。

一切蛋白质或二肽以上的多肽部有双纳脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

(二)茚三酮反应

1.原理：

除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。

该反应十分灵敏，1：1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。

茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO₂、NH₃和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分于和氨缩合生成有色物质。

此反应的适宜pH为5—7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。

(三)黄色反应：

1.原理：

含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。

多数蛋白质分子台有带苯坏的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。

(四)沉淀反应：

在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颖拉可因失去电荷和脱水而沉淀。

蛋白质的沉淀反应可分为两类。

(1)可逆的沉淀反应：

此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇(或丙酮)短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。

(2)不可逆沉淀反应：

此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金届离子或某些有机酸的反应都属于此类。

蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷)，并不析出。因此变性蛋白质并不一定部表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。

四、实验方法与步骤

(一)双缩脲反应：

取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10％氢氧化钠溶液约1毫升，振荡混匀，再加1％硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。

向另一试管加卵清蛋白溶液约l毫升和10％氢氧化钠溶液约2毫升，摇匀，再加1％硫酸铜溶液2滴，随加随摇，观察紫玫色的出现。

(二)茚三酮反应

取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1毫升，再各加0.5毫升0.1％茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1—2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。

在一小块滤纸上滴一滴0.5％的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一滴0.1％的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。

(三, )黄色反应：

于一试管内，置蛋白质溶液10滴及浓硝酸3~4滴，加热，冷却后再加10%NaOH溶液5滴，观察颜色变化。

(四)沉淀反应：

(1)蛋白质的盐析。

无机盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等)浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。

如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。

由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。

加5％卵清蛋白溶液5毫升于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混蚀沉淀，加少量水，是否溶解，为什么？将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，l此时析出的沉淀为清蛋白。取出部分清蛋

白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。

（2）乙醇沉淀蛋白质

乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体质点的水化层而使其沉淀析出。

取蛋白质溶液1ml,加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后加入95%乙醇2ml混匀。观察有无沉淀析出。

（3）重金属盐沉淀蛋白质

蛋白质与重金属离子结合成不溶性盐类而沉淀。

取试管2支各加蛋白质溶液2 ml，一管内滴加1%醋酸铅溶液，另一管内滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀生成。

五、实验要求

同上

六、场地、设备与器材

12幢新实验大楼1楼生化实验室

1．水浴锅。

2．温度计。

3．吸管。

4．试管。

5．试管架。

6．酒精灯。

《生物化学实验B》课程实验项目5

一、实验目的

通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法

二、实验内容

进行氨基酸的纸层析及定性鉴定。

三、实验原理

纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移)来表示的：

Rf = 原点到层析中心的距离 / 原点到溶剂前沿的距离

在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。

四、实验方法与步骤

1、取扩展剂约100mL置于密闭的层析缸中。

2、取层析滤纸(长15 cm、宽8 cm)一张。在纸的一端距边缘2～3 cm处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号。

3、点样:用毛细管将各氨基酸样品分别点在这4个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径，最大不超过3 mm。

4、扩展:用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1 cm)。待溶剂上升15―20 cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。

5、显色:用喷雾器均匀喷上0。1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。

6、计算各种氨基酸的Rf值。

五、实验要求

同上

六、场地、设备与器材

12幢新实验大楼1楼生化实验室

1、层析缸   2、毛细管   3、喷雾器   4、培养皿   5、层析滤纸

《生物化学实验B》课程实验项目6

一、实验目的

1．了解离子交换树脂层析法的工作原理及操作技术。

2．学会用离子交换构脂层析法分离混合氨基酸。

二、实验内容

本实验用磺酸型阳离子交换树脂分离酸性氨基酸（天冬氨酸

和碱性氨基酸（赖氨酸）的混合液。

三、实验原理

在特定的pH条件下，酸性氨基酸（天冬氨酸）、和碱性氨基酸（赖氨酸）的解离程度不同，所以与离子交换树脂的亲和力也不同，通过改变洗脱液的pH或离子强度可分别洗脱而达到分离。

四、实验方法与步骤

1．装柱前准备

用流水冲洗层析柱、然后用蒸馏水冲洗，柱流水口装上橡皮管放入2-3ml蒸馏水，按压橡皮管内气泡，抬高流出管防止蒸馏水排空。

2．装柱

将处理好的磺酸型阳离子交换树脂悬液小心倒入层析柱内，待磺酸型阳离子交换树脂自然下沉至柱下部时，打开下端放出液体，再慢慢加入悬液至磺酸型阳离子交换树脂沉积面离层析柱上缘约3cm时停止。装柱时注意防止液面低于交换树脂平面以及气泡的产生。

3．平衡

用pH4.2的柠檬酸钠缓冲液反复加在柱床上面，平衡10min，最后接通蠕动泵，调节流速 1ml/min。

4．加样

柱内缓冲液的液面与树脂平面相平，但勿使树脂露出液面，马上用**滴管加7滴样品在树脂平面上（注意不能使树脂平面破坏），然后加少量缓冲液使样品进入柱内，反复两次，当样品完全进入树脂床后，接通蠕动泵，用PH4.2的柠檬酸钠缓冲液洗脱，部分收集器收集。

5.收集与检测

取12支试管编号，每管即加入茚三酮显色液20滴，依次收集洗脱液每管2m1，混匀，置沸水浴15min取出，观色，用自来水冷却后在波长570mm处比色、当收集至第二洗脱峰刚出现时，(茚三酮显色)即换用0.1N  NaOH溶液洗脱直至第三洗脱峰出现后，停止洗脱。

6．树脂的再生

用o.1N NaOH溶液洗脱层析柱l0min。

7．回收树脂

拔去橡皮接收管用洗耳球对着玻璃流出口将树脂吹入装树脂的小瓶内加入 0.1N NaOH浸泡。

8．洗脱曲线的绘制

最后以洗脱液各管光密度(以水作空白，在570nm波长读取光密度)或颜色深浅(以﹣、±、+、++……表示)为纵坐标，洗脱液管号为横坐标作图，即可画出一条洗脱曲线。

五、实验要求

同上

六、场地、设备与器材

12幢新实验大楼1楼生化实验室

1、试管

2、橡皮管

3、量筒

4、层析柱

5．恒流泵

6、分光光度计

7．自动收集装置

《生物化学实验B》课程实验项目7

一、实验目的

学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳枝术的一般原理。

二、实验内容

用醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白

三、实验原理

醋酸纤维薄膜电泳(CAME)是以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物

的一种区带电泳技术，将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8．6的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。电泳后，经染色和漂洗，可清晰呈现清蛋白、α₁、α₂、β、γ—球蛋白5条区带。

四、实验方法与步骤

l．将电泳槽置于水平平台上。将缓冲液注入电泳槽中，两边的电极槽缓冲液的高度要在同一平面。

2．在醋纤膜无光面用铅笔作好标记，将薄膜放进缓冲液中浸润约20分钟。

3．将充分浸透的薄膜取出，用滤纸吸去膜上过多的缓冲液。

4．用加样器蘸取血清，垂直印在CAM无光面离一端约2厘米处。

5．电泳

⑴加样后，将薄膜条架于支架两端，点样面朝下，点样侧置于负极端，膜两侧分别搭上滤纸，滤纸一端垂入缓冲液中。薄膜应位正，平直无弯曲，加上槽盖平衡5分钟后通电电泳。

(2) 正确连接电泳槽与电泳仪对应的正负极，开启电源通电。电流强度0.4-0.7mA/cm膜总宽。电泳约40分钟。

6．染色：电泳完毕后断电，用镊子取出薄膜条投入染液5-10分钟，染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。

7．漂洗：从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入漂洗皿中反复漂洗，直至背景漂净为止。此时清晰可见5条色带，待干。

五、实验要求

同上

六、场地、设备与器材

12幢新实验大楼1楼生化实验室

1．醋酸纤维薄膜(8X2cm)

2．点样器

3．染色皿，漂洗器，镊子

4．电泳仪：直流电源整流器，水平电泳槽

《生物化学实验B》课程实验项目8

一、实验目的

1.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理

2、掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术

二、实验内容

用聚丙析酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白

三、实验原理

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的一种区带电泳。聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺和交联剂亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下，聚合交联成含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。聚丙烯酰胺具有网状立体结构，很少带有离子的侧基，惰性好，电泳时，电渗作用小，几乎无吸附作用，对热稳定，呈透明状，易于观察结果。由于此种凝胶具有分子筛的性质，所以本法对样品有分离作用。不仅决定于各组分所带的净电荷的多少，也与分子大小有关，其次，聚丙烯酰胺凝胶还有一种独特的浓缩效应，即在电泳开始后，由于不连续的PH梯度的作用，将样品压缩与一条狭窄的区带，从而提高样品的分离效果。

四、实验方法与步骤

1.分离胶的制备：将电泳用的玻管，洗净烘干；同时将需要的凝胶储备液从冰箱中取出，放至室温备用。

(1)电泳玻璃管的准备：取一根洁净的电泳玻璃管，垂直放在青霉素瓶盖的凹穴中，用1%的琼脂密封，备用。

(2) 分离胶 (小孔胶)的制备：

取一小烧杯，按表1的比例混合，用滴管吸取一定量胶液小心加入到玻璃管内，在加的过程中注意不要混进空气，当加到液面距离电泳玻璃管上口2cm时停止。

另取一带弯头的注射器在其上面小心覆盖0.5cm高的蒸馏水层，勿使加入的蒸馏水与胶液混合。刚加入水层时在水层和胶面的交接处可见一明显的折光面，此折光面会逐渐消失，等再次出现时标志分离胶聚合已经开始，聚合30~60分钟后用滤纸小心吸去表面的水层，切勿破坏胶面的完整性。

2.待分离样品的制备：

40%蔗糖10μl，血清10μl，溴酚蓝5μl混匀备用。

3.加样：

将制好的胶管装入电泳槽中调节高度并塞紧，防止电泳中产生漏液。然后分别在电泳槽的上下槽体内注入电泳缓冲液，下槽的液面应没过玻璃管的下管口（注意不要有气泡存在）和电极丝；上槽的液面应没过玻璃管口0.5 ~1cm。用微量注射器吸取30μl的样品，小心的加入电泳玻璃管内，注意不要让样品溢出管口。

4.电泳

将电泳仪和电泳槽连接，负极在上，正极在下，开通电源。电流可调节到3~5mA/管，当溴酚蓝到凝胶下端附近时电泳结束。

5.剥胶

电泳结束后，取下玻璃管，用带长针头的注射器从浓缩胶一端紧

贴玻璃管壁缓慢插入针头，一面注入蒸馏水一面缓慢旋转玻璃管同时推针前进。靠水流的压了力和润滑作用使凝胶和玻璃管的内壁分开，待水流从另一端流出时，再慢慢将针头退出。注意操作中不要把胶条搅碎。退出针头后将针头去掉，用注射器向玻璃管中快速注水，将胶条从玻璃管中那个压出。

6.固定染色

将取下的胶条放入染色液氨基黑10B中，在室温下，固定染色10min。

7.洗脱

将染色完毕的胶条用脱色液浸泡，中间更换1~2次脱色液并

浸泡过夜，将浮色脱去进行观察染好色的蛋白带，胶条可以制成干胶长期保存。

表1：分离胶配方表

五、实验要求

同上

六、场地、设备与器材

12幢新实验大楼1楼生化实验室

1．移液器

2．电泳仪

3．圆盘电泳槽

4．电泳玻璃管

5．脱色摇床

6．青霉素小瓶盖培养皿弯头注射器微量注射器长针头注射器烧杯

《生物化学实验B》课程实验项目9

一、实验目的

加深对酶的性质的认识目的

二、实验内容

本实验由温度对酶活力的影响，；酶的激活剂及抑制剂；酶的专

一性3组实验组成

三、实验原理

（一）温度对酶活力的影响

酶的催化作用受温度的影响。在最适温度下，酶的反应速度最高。大多数动物酶的最适温度为37-40℃，植物酶的最适温度为50-60℃。

酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，虽加热到100℃，其活性并无明显的改变，但在100℃的溶液中却很快地完全失去活性。低温能降低酶或抑制酶的活性，但不能使酶失活。

淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色，糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈色，在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。

（二）唾液淀粉酶的活化及抑制　　

酶的活性受活化剂或抑制剂的影响，氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。

（三）　酶的专一性

酶具有高度的专一性。本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。

淀粉和蔗糖无还原性，唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能蔗糖水解产生还原性葡萄糖和果糖。但能催化淀粉的水解。用Benedict试剂检查糖的还原性。

四、实验方法与步骤

　（一）温度对酶活力的影响

取3支干燥的试管，编号后按下表加入试剂：

表1　温度对酶活力影响实验加样顺序

摇匀后，将1、3号试管放入37℃恒温水浴中，2号试管放入冰

水中。10分钟后取出（将2号内液体分两半），用KI－I₂溶液来检验1、2、3号管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果。将2号管剩下的一半溶液放入37℃水浴中继续保温10分钟后，再用KI－I₂液实验，记录实验结果。

（二）唾液淀粉酶的活化及抑制

见下表

表3　唾液淀粉酶活化及抑制实验加样顺序

（三）　酶的专一性

(1) 淀粉酶的专一性　　

表4淀粉酶专一性加样顺序

(2)蔗糖酶的专一性

表5蔗糖酶专一性加样顺序

五、实验要求

同上

六、场地、设备与器材

12幢新实验大楼1楼生化实验室

1．试管及试管架　　

2．恒温水浴　　

3．冰浴　

4．沸水浴

《生物化学实验B》课程实验项目10

一、实验目的

1.了解转氨酶的性质及临床意义。

2.掌握谷丙转氨酶活力的测定方法。

3.学习并掌握分光光度计的原理和操作方法。

二、实验内容

用分光光度法测定血液中转氨酶活力

三、实验原理

在氨基酸的分解代谢过程中，联合脱氨基地大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与氧化脱氨基的作用偶联而完成。本实验以丙氨酸和a-酮戊二酸作为谷丙转氨酶的作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作为辅酶，在一定条件及时间作用后来测定所生成的丙酮酸的含量来确定其酶的活力。丙酮酸能与2，4二硝基苯肼结合，生成丙酮酸-2，4二硝基苯腙，后者在碱性条件溶液中呈棕色，基吸收光谱的峰为439-530nm，可用于测定丙酮酸的含量。

a-酮戊二酸与能与2，4二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中的吸收光谱与丙酮酸二硝基苯肼稍有差别，在520nm波长处a-酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远比丙酮酸2，4二硝基苯腙为低，因此在520nm处吸光度增加的程度与反应体系中的丙酮酸和a-酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系。故可籍此可测定谷丙转氨酶的活力。

四、实验方法与步骤

1.样品的制备（集体制备）

将鸡处死，取鸡血 4000rpm冷冻离心10分钟后取上清保存在冰水中备用。

2.样品测定

混匀后，静置10min，于520nm波长处进行比色，读取测定管

与对照管的吸光度，将测定管的吸光度减去样品管的吸光度后与标准管进行比较算出相当于丙酮酸的含量。

3.谷丙转氨酶活力计算：

本法规定酶在37℃与底物30min后能产生2.5ug的丙酮酸者为

一个谷丙转氨酶活力单位。

五、实验要求

同上

六、场地、设备与器材

12幢新实验大楼1楼生化实验室

1．研钵

2．试管试管架玻璃搅拌棒滴管容量瓶

3．电子天平

4．分光光度计

5．吸管

《生物化学实验B》课程实验项目11

一、实验目的

1．了解底物浓度与酶反应速度间的关系。

2．学习求蔗糖酶米氏常数的方法。

3．学习并掌握分光光度计的原理和操作方法。

二、实验内容

用双倒数法测定蔗糖酶米氏常数

三、实验原理

在酶的研究应用中，人们经常会遇到底物浓度对酶反应速度的影响的问题。Michaelis和Menten得到了一个表示底物浓度与反应速度之间相互关系的方程式，称为米氏方程式。

式中，v为最大反应速度，Km为米氏常数。

由上式可见，米氏常数是当酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。其单位是浓度单位，一般用mol／L或mmol／L表示。Km是酶的特征性物理常数。一种酶，在一定的实验条件(25℃，最适pH)下，对某一种底物，有一定的Km值。不同的酶有不同的Km值。因此，测定酶的Km值可以作为鉴别酶的一种手段。

米氏常数的求法很多，最常用的是LineweaVer—Burk的作图法(双倒数作图法)。

将米氏方程式改写为下列倒数形式：1／V_O=Km／Vmax·1／[S]+1／Vmax

实验时，选择不同的[s]，测定相应的v，求出两者的倒数，以1/[s]为横坐标，以1/υ吉为纵坐标作图，绘出一条直线，外推至横轴相交，横轴截距即为-1/Km。此法由于方便而应用最广，但亦有缺点，实验点过分集中于直线的左端，因而作图不易十分准确。

四、实验方法与步骤

1．葡萄糖标准曲线的制定

取6支血糖管（大试管），分别按下表加入试剂：

将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即用冷水冷却至室温，以蒸馏水稀释至25ml，摇匀。测540nm处A值。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，A值为纵坐标作出标准曲线。

2．底物浓度和初速度υ测定

取试管7支，按1～7编号，1号为空白。

按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分别加入7支试管中，于25℃水浴中保温10min。

3．取约30mL酶液，放入同一水浴中保温约10min。

4．于各管中依次按同样时问间隔(1min或2min)加人已保温过的酶液1.0mL，计时，立即摇匀，在35℃水浴中作用5min。

5．按同样次序和时间问隔，加入5mL 1mol／L NaOH，摇匀，终止反应。

6．吸取反应物1.0mL，加入盛有3.0mL 3，5-二硝基水杨酸试剂和1.0mL水的血糖管中；取第8支试管，加水2.0mL，加3.0mL 3，5-二硝基水杨酸试剂，都放入沸水浴中加热5min，冷却后稀释至25mL，摇匀，在540nm比色测定OD值。

7. 以OD值为相对反应速度，以1/[S]为横坐标，1/OD为纵坐标作图，由图求出Km值。

8．另取12支试管，重复上述操作。

五、实验要求

同上

六、场地、设备与器材

12幢新实验大楼1楼生化实验室

1．721分光光度计

2．恒温水浴

3．试管

4．吸量管

5．秒表

6．坐标纸

《生物化学实验B》课程实验项目12

一、实验目的

1．了解核酸的组成，掌握鉴定核酸组分的方法。

2．学习并掌握离心机的使用方法。

二、实验内容

提取酵母中核糖核酸后，用特征反应鉴定其组成

三、实验原理

酵母核糖核酸中RNA含量较多，RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，即得到RNA的粗制品。

核糖核酸中含有核糖、嘌蛉碱，嘧啶碱和磷酸各组分，加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。

在酸性条件下，RNA分子中的核糖基可转变为α-- 呋喃甲醛，

后者可以与苔黑酚（3.5 -- 二羟基甲苯）作用生成绿色复合物，此复合物在670nm处有最大吸收。

四、实验方法与步骤

（一）酵母RNA的提取：

1、将15g酵母悬浮于90ml0.04 M NaOH溶液中，并在乳钵中研磨均匀，将悬浮液转移到150ml锥形瓶中，在沸水上加热30分钟，期间不时搅拌。冷却后转入离心管进行离心（操作时先以少量 NaOH溶液湿润酵母，并进行充分研磨，再用剩余的NaOH溶液冲洗研钵一起转入离心管）。离心15min（3000rpm）将上清液缓缓倾入30ml酸性乙醇溶液中，待核糖核酸沉淀完全后，离心3min（3000rpm），弃去上清。用95%乙醇洗涤沉淀，离心3min（3000rpm）弃去上清液，共进行两次。然后用乙醚洗涤沉淀一次，离心3min（4000rpm）弃去上清液，沉淀可在空气中干燥，即为酵母RNA的粗制品。

2、待测样液的制备：

取200mg 提取的核酸，加入1.5 M H₂SO₄ 10ml ，在沸水浴中10加热分钟后制成水解液并进行组分的鉴定。

3、组分的鉴定：

①嘌呤碱：取水解液1ml加入过量的浓氨水，然后加入约1ml0.1 M AgNO₃溶液观察溶液的变化。

②核糖：取1支试管加入水解液1ml，加苔黑酚--FeCl₃溶液１ml，放沸水浴中10分钟，注意溶液颜色的变化。

③磷酸：取1支试管，加入水解液1ml和定试剂1ml，在水浴中加热，观察溶液颜色的变化。

五、实验要求

同上

六、场地、设备与器材

12幢新实验大楼1楼生化实验室

1．研钵、锥形瓶、量筒、吸量管、滴管、试管、试管及试管架、烧杯、玻璃棒

2．电子天平

3．离心机

4．恒温水浴锅、电炉

5．分光光度计（721）

《生物化学实验B》课程实验项目13

一、实验目的

1．了解酶的提取与分离的方法。

2．理解过氧化物酶的测定原理。

3．掌握生物组织中过氧化物酶的功能。

4．学习并掌握分光光度计的原理和操作方法。

二、实验内容

用分光光度法测定生物组织中过氧化物酶的活性

三、实验原理

过氧化物酶广泛分布于生物体的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量，用以表示过氧化物酶活性。

过氧化物酶活性还可以用氧电极法测定，测量在单位时间内释放氧气的量，该方法灵敏快速。

四、实验方法与步骤

1、称取植物材料1g，剪碎，加5ml  20 mmol/L KH₂PO₄溶液，与研钵中研磨成浆（夏天实验时用冰浴），4000r/min条件下离心15分钟，上清液倒出，保存在低温下；残渣再用5ml  20 mmol/L KH₂PO₄溶液提取1次，合并两次上清液，为过氧化物酶液。贮藏于冷处备用。

2、取光径1cm比色杯2只，1只加入反应混合液3ml，KH₂PO₄ 1ml,作为校零对照；另一只中反应混合液3ml，过氧化物酶液1ml（如酶活性过高，可以稀释），立即开启秒表记录时间，在分光光度计上测量470nm下的吸光度值，每隔1分钟读数一次。

3、以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即用⊿A₄₇₀/min.mg蛋白质（或鲜重g）表示。

五、实验要求

同上

六、场地、设备与器材

12幢新实验大楼1楼生化实验室

1．721或751分光光度计

2．离心机

3．秒表、天平、研钵、磁力搅拌器；

《生物化学实验B》课程实验项目14

一、实验目的

1. 学习维生素C定量测定法的原理和方法。

2. 熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技能

二、实验内容

用微量滴定法测定植物组织中维生素C的含量

三、实验原理

维生素C具有很强的还原性。在硷性溶液中加热并有氧化剂存在时，维生素C易被氧化而破坏。在中性和微酸性环境中，维生素C能将染料2,6-二氯酚靛酚还原成无色的还原型2,6-二氯酚靛酚，同时维生素C氧化成脱氢维生素C。

氧化型的2,6-二氯酚靛酚在中性或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色，被还原后即失去红色。根据滴定时2,6-二氧酚靛酚溶液的消耗量，可以计算出被测物质中维生素C的含量。

四、实验方法与步骤

1．不同样品用不同方法提取

(1)松针：水洗净，用滤纸吸去表面水分。称取1．0g，放入研钵中，加1%HCl溶液5m1一起研磨。放置片刻，将提取液转入50 m1容量瓶中。如此反复2—3次。最后用1％HCl溶液稀释到刻度并混匀，静置10分钟，过滤，滤液备用。

    (2)新鲜蔬菜和水果类：水洗净，用纱布或吸水纸吸干表面水分。然后称取20．0g，加2％草酸100m1置组织搅碎机中打成浆状。称取浆状物5．0g，倒入50 m1容量瓶中以2％草酸溶液稀释至刻废。静置10分钟，过滤(最初数m L滤液弃去)。滤液备用。

    2．滴定

    (1)标准液滴定：准确吸取标准抗坏血酸溶液1．0ml(含0．1mg抗坏血酸)置100 ml锥形瓶中，加9ml1%草酸，微量摘定管以0．1％2，6—二氯酚靛酚滴定至淡红色，并保持15秒钟即为终点。由所用染科的体积计算出1m1染料相当于多少mg抗坏血酸。

(2)样液滴定：准确吸取滤液两份，每份10．0 m1分别放人二个l00 m1锥形瓶内，滴定方法同前。

注意：摘定过程宜迅速，一股不超过2分钟。滴定所用的染料

不应少于1ml或多于4m1，如果样品含抗坏血酸太高或太低时，可酌量增减样液

五、实验要求

同上

六、场地、设备与器材

12幢新实验大楼1楼生化实验室

1．吸管1．0m1(×1)、10m1(×1)．

2．容量瓶100ml(×1)。

3．锥形瓶100m1(×3)。

4．微量滴定管2m1(×1)．

5．研钵。

6．漏斗Φ8cm(×2)。

《生物化学实验B》课程实验项目15

一、实验目的

1．加强对蛋白质的有关性质的认识；

2．掌握一种测定蛋白质含量的原理和方法；

3．对学生所学进行综合的测试。

二、实验内容

用一种常用方法测定蛋白质含量（如双缩脲法）

三、实验原理

蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲法反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu²⁺形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量氨基酸成分无关，因此利用此进行比色测定蛋白质含量。

在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540—560nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知的蛋白质浓度，标准蛋白溶液可以用结晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。

四、实验方法与步骤

1、标准曲线的制作

取6支干净的试管，按0→5编号，然后按下表依次加入试剂，充分混匀，在室温下放置半小时，以管为空白，在550nm波长处测定消光值（OD），以各管蛋白质含量（毫克）横坐标，OD值为坐标，画出标准曲线。

2、样品测定：取样品液2.0 ml，同法进行，测其OD值，对照标准曲线求得未知液蛋白质浓度。

3、分光光度计的使用：规定每组在10min以内全部完成操作（共测6支管）；同时注意操作是否规范。

五、实验要求

实验内容要求：充分预习，独立完成。及时记录实验中观察到的现象、结果和数据，原始数据必须准确简练、详尽、清楚。记录时不能夹杂主观因素，在定量实验中观测的数据，如称量物的重量、滴定管的读数、光密度值等，都应设计一定的表格，依据仪器的精确度记录有效数字。

实验报告要求：

实验报告应包括下列各项：

（1）预习报告

（2）报告的题目（要简明确切）；

（3）实验目的；

（4）实验原理；

（5）实验仪器和试剂（包括主要仪器的规格、主要试剂的名称）；

（6）实验数据记录（包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格）；

（7）实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算或用文字说明

（8）分析与讨论，要对实验结果作出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏；

（9）回答思考题。

考核评价要求：以预习情况、实验操作情况和实验报告等为主

要考核内容

六、场地、设备与器材

12幢新实验大楼1楼生化实验室

1．试管和试管架

2．吸管

3．分光光度计