《生化药物制备技术》课程实验教学大纲

一、课程概况（CourseOverview）

课程名称：生化药物制备技术

Course：Experiment of biochemical medicament preparation technique

课程编号：0081800017                             适用学生:生物技术专业

Course Number：0081800017                   Designed for:Biotechnology

学分：1学时： 36          独立设课：是

Credit：   1         Class hour: 36Independent course：yes

预修课程：《生物化学》、《生物化学实验》、《天然药物化学》

Preparatory courses: Biochemistry、Biochemistry experiment、Natural medicines

二、课程简介（Course  Descriptions）

生化药物制备技术是一门实验性课程。通过该课程的学习, 使学生掌握生化制备常用技术，培养学生的动手能力及严谨的科学态度。该课程学习药物的生化制备常用技术，包括提取、分离纯化及检测等一系列主要操作，了解一些生化物质的制备过程和方法。

Experiment of biochemical medicament preparation techniqueis one experimental curriculum, which make students to gain of consummate skill about biochemical preparation technique, and cultivate students’ hands-on skill and religious scientism. This course mainly teach students the ordinary technique of biochemical preparation, including extraction, separation, purification, and analysis, and make students acquaint oneself with the process and techniques of biochemical preparation.

三、实验项目一览表(Experiment project schedule)

四、推荐教材及参考书目 (Recommended Teaching Materials and Reference Books)

1.推荐教材

《生物化学产品制备技术》，陈来同、唐运编著，北京科学技术文献出版社，2003

Recommended Teaching Materials:

2.参考书目

《生物化学制备技术》第三版，苏拔贤主编，2001

Reference Books

五、考核与评价方式(Course Evaluation)

考核方式：考查

Course Evaluation: Evaluation

六、场地、设备与器材(Site, equipment and consumable materials)

所用设备与器材：

电炉、离心机、水浴锅、可见光分光光度计、移液管、移液枪、自动搅拌器、冰箱、真空干燥箱、紫外分光光度计、精密天平、旋转蒸发仪、通风橱等。

Equipment and consumable materials

electric cooker, centrifuge, electric-heated thermostatic water bath, spectrophotometer, piette, stirring apparatus, refrigeratory, vacuum-drying oven, precision balance, rotary evaporator, stink cupboard, etc.

撰写人：杨莉审定人：

《生化药物制备技术》课程实验项目1

银耳多糖的制备

一、实验目的

学习和掌握银耳多糖粗品的制备方法和原理。

二、实验内容

银耳多糖粗品的制备。

三、实验原理

银耳是我国一种传统的珍贵药用真菌，具有滋阴润肺，益胃生津等功效，常用于治疗虚劳咳嗽、阴伤燥咳、虚热口渴等症。银耳多糖是银耳的主要药效成分，银耳多糖能改善人体免疫功能，增强巨噬细胞的巨噬功能，也具有提升白细胞的功能. 长期服用银耳多糖能降低血压血脂，防止动脉硬化，抑制肿瘤，增强机体免疫功能，有延缓衰老和护肤功效。

银耳子实体经沸水抽提，Sevag法除蛋白（氯仿-正丁醇 1/5，1/25），乙醇沉淀分离即可制得银耳多糖粗品。

银耳多糖溶于热水，不溶于冷水、乙醇。

四、实验方法与步骤

1、银耳3g，洗净（若较为干净，省略该步），剪碎，加200-400 ml 水，加少量NaHCO₃ (加速溶化)，直火加热至沸，搅拌提取2 h，双层纱布过滤，得提取液（约70-80 ml，在煮沸过程中防止糊锅，影响提取质量）。

2、提取液中加（提取液的）1/5氯仿、（提取液的）1/25正丁醇振摇10min，分层，离心（4000 rpm, 10 min），去下层杂蛋白，重复3次左右，得到去蛋白的多糖液（约10-20 ml）。

3、去蛋白的多糖液加3倍体积乙醇（多糖液的），离心得沉淀，丙酮脱水（丙酮盖过多糖，挤压，弃丙酮），真空干燥，获得银耳多糖粗品，下次实验备用。

五、实验要求

实验内容要求：（1）在煮沸过程中防止糊锅，影响提取质量；（2）用Sevag法除蛋白要除尽蛋白，一般要3-5次，至无乳化。

实验报告及考核评价要求：能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论。

六、场地、设备与器材

实验场地：待定

实验设备与器材：电炉、离心机、精密天平、剪刀、量筒、培养皿、通风橱等

《生化药物制备技术》课程实验项目2

银耳多糖含量的测定

一、实验目的

学习和掌握多糖含量测定的原理和方法。

二、实验内容

测定实验1提取银耳多糖的含量。

三、实验原理

多糖在浓硫酸中水解，进一步脱水生成糖醛及其衍生物，与蒽酮（10-酮-9,19-二氢酮）反应生成蓝绿色复合物，在620nm处有最大吸收值。以标准葡萄糖溶液作标准，在620nm波长处进行比色，可计算出总糖的含量。

（1）糖经浓无机酸处理后，脱水生成糠醛或糠醛衍生物；

（2）这些糠醛和糖醛衍生物在浓无机酸的作用下，能与蒽酮化合物反应生成有色物质。

四、实验方法与步骤

1、标准曲线的制作：分别取0.1mg/ml的葡萄糖溶液0.00，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80ml，用蒸馏水补到1.00 ml；分别加入3.00 ml蒽酮试剂，混匀，一起进入沸水浴中。自水浴重新煮沸起，准确煮沸10分钟取出，冷却至室温于620 nm比色。以第一管为空白对照，进行比色。以光密度(OD值)为纵坐标，糖的含量微克数为横坐标，得标准曲线。

2、样品含量测定：取样品溶液0.20 ml 、0.50 ml，分别加入蒽酮试剂，同标准曲线制作之操作，比色测定。根据标准曲线和样品浓度计算含量。

五、实验要求

实验内容要求：在使用移液管移取溶液时尽量准确，否则会影响实验结果的准确性。

实验报告及考核评价要求：能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论。

六、场地、设备与器材

实验场地：待定

实验设备与器材：恒温水浴锅、可见分光光度计、试剂瓶、移液枪、移液管、移液管架、试管架、试管、试管夹、滤纸、通风橱等

《生化药物制备技术》课程实验项目3

猪胃粘膜中提取胃膜素、胃酶

一、实验目的

学习从猪胃粘膜中提取胃膜素、胃酶的原理和方法，了解有机溶剂分级沉淀法的应用。

二、实验内容

从猪胃粘膜中提取胃膜素、胃酶。

三、实验原理

胃蛋白酶存在于动物胃液中，以无活性的胃蛋白酶原形式，存在于胃底的主细胞中，在酸性条件下，胃蛋白酶原变化成有消化蛋白质能力的胃蛋白酶。在医学上主要用于治疗消化不良、食欲不振、慢性胃炎等，工业上可用水解蛋白用。干燥的胃蛋白酶为白色或淡黄色粉末，引湿性强，易溶于水；对热较稳定，100 ℃10 min不破坏，水溶液中，70 ℃以上破坏。

胃膜素：自猪胃黏膜提取的胃膜素，为白色至黄白色粉末或黄褐色颗粒，是一种以粘蛋为主要成分的药物，有蛋白胨样臭味，稍有咸味，着水涨为黏浆，呈微溶状态，水溶液呈灰色或乳白色，遇弱酸即沉淀。遇热不凝固，在溶液中能被60％以上乙醇或丙酮沉淀。胃膜素中的粘蛋白，能抵抗胃蛋白酶的消化和吸附胃酸，1g干粘蛋白能力与15 ml 0.1M HCl结合。胃膜素对胃和十二指肠溃疡能起生理上的保护和润滑作用，临床上用于胃及十二指肠溃疡。

胃粘膜一般指胃底粘膜，分泌胃液的主细胞集中在胃底粘膜，呈暗红色，直径约10-12厘米圆块，约100 g。胃膜素是从猪胃粘膜经胃蛋白酶和盐酸消化后的上层液中60%左右的乙醇所沉淀的部分。蛋白质、酶等极性物质的水溶液加入与水混溶的有机溶剂，可沉淀析出。

四、实验方法与步骤

1.激活提取：猪胃粘膜1.1 Kg（10只猪肚）+水约400 ml升（胃粘膜的40%），用1：1盐酸调pH 2.5-3.0，45-50 ℃搅拌提取3 h。

2.脱脂分层：双层纱布过滤，冷却至室温，缓慢加入约100ml氯仿（胃粘膜的10%，），搅拌2 h，室温静置24 h后，放掉底层的氯仿和杂质，上清液预冷至5℃以下；

3. 胃膜素分离：上清液在搅拌下缓缓加入预冷至5℃以下的丙酮（γ=0.708）至比重约0.97，捞出胃膜素，以适量的75%乙醇洗两次，真空干燥。

4.胃酶的沉淀：母液再加丙酮至比重约0.91，有黄色沉淀产生，静置1 h，离心取沉淀，70℃以下真空干燥。

五、实验要求

实验内容要求：（1）在搅拌的过程中需注意不停的调节pH；（2）在脱脂分层过程中氯仿的加入要缓慢。

实验报告要求及考核评价要求：能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论。

六、场地、设备与器材

实验场地：待定

实验设备与器材：恒温水浴锅、自动搅拌器、冰箱、真空干燥箱、天平、滴管、纱布、剪刀、玻棒、离心机、培养皿、pH试纸、陶瓷杯、通风橱等

《生化药物制备技术》课程实验项目4

胃蛋白酶活力的测定

一、实验目的

学习和掌握以牛血红蛋白为底物的胃蛋白酶活力测定的原理和方法，掌握紫外分光光度计的使用。

二、实验内容

以牛血红蛋白为底物测定猪胃蛋白酶活力。

三、实验原理

胃蛋白酶能催化水解芳香环氨基酸连接的肽键。在一定条件下，可定量催化水解牛血红蛋白产生不被三氯醋酸（TCA）所沉淀的酚基氨基酸（如酪氨酸）。酪氨酸在275nm波长处有最大吸收，以酪氨酸为对照，可以求出胃蛋白酶活力。

四、实验方法与步骤

1、对照品溶液的制备：精密称取经105℃干燥至恒重的酪氨酸适量，加盐酸溶液〔取1mol/l盐酸溶液65ml，加水至1,000ml 〕制成每1ml 中含0.5mg 的溶液，摇匀，备用。

2、供试品溶液的制备：精密称取实验二提取的胃酶干粉40-60mg，用上述盐酸溶液制成每1ml 中约含 0.2 ～0.4U 的溶液。（称本品（一般4000U/g以上）40-60mg，用上述盐酸溶液定容至100 ml，再取5 ml用上述盐酸溶液定容至50 ml，即0.04-0.06 mg/ ml）。

3、测定方法：取试管6 支，其中3 支各精密加入对照品溶液1ml ，另3 支各精密加入供试品溶液1ml ，置37±0.5 ℃水浴中，保温5 分钟，精密加入预热至37±0.5 ℃的牛血红蛋白试液5ml ，摇匀，并准确计时，在37±0.5 ℃水浴中反应10分钟。立即精密加入5% 三氯醋酸溶液5ml ，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液备用。另取试管2 支，各精密加入血红蛋白试液5ml ，置37±0.5 ℃水浴中保温10分钟，再精密加入 5％三氯醋酸溶液5ml ，其中1 支加供试品溶液1ml ，另1 支加对照样品盐酸溶液1ml ，摇匀，过滤，弃初滤液，取续滤液，分别作为供试品和对照品的空白对照，按照分光光度法在275nm 的波长处测定吸收度，算出平均值ＡS 和Ａ，按下式计算。

Ａ×Ｗｓ×ｎ

每g含蛋白酶活力单位数＝　───────────

Ａs×Ｗ×10×181.19

式中：ＡS 为对照品的平均吸收度；Ａ为供试品的平均吸收度；Ｗs ＝1 ml 对照品溶液中含酪氨酸的量，μg ；W＝供试品取样量，g ；n＝供试品的稀释倍数。

在上述条件下，每分钟能催化水解血红蛋白生成1 μmol 酪氨酸的酶量，为一个蛋白酶活力单位。

五、实验要求

实验内容要求：在使用移液管移取溶液时尽量准确，否则会影响实验结果的准确性。

实验报告要求及考核评价要求：能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论。

六、场地、设备与器材

实验场地：待定

实验设备与器材：恒温水浴锅、紫外分光光度计、移液枪、移液管、移液管架、试管、试管架、试管夹、滤纸、擦镜纸、通风橱等

《生化药物制备技术》课程实验项目5

高纯度卵磷脂的制备

一、实验目的

学根据物质在不同溶剂中溶解能力不同原理，学习从蛋黄中提取高纯度卵磷脂粗品的一般方法。

二、实验内容

从鸡蛋中提取卵磷脂。

三、实验原理

卵磷脂是磷脂中的一种，是生物体组织细胞的重要成分，是细胞膜、内质网膜、线粒体膜的主要成分之一，在膜结构中起着骨架的作用。卵黄中卵磷脂含量较高。卵磷脂主要存在于大豆等植物组织以及动物的肝、脑、脾、心等组织中，尤其在蛋黄中含量较多(10 %左右)。

新提取的卵磷脂为白色蜡状，在空气中其不饱和脂肪酸被氧化而黄褐色，有吸湿性。

纯卵磷脂不溶于水，易溶于乙醇、氯仿、乙醚和二硫化碳，但不溶于丙酮。利用后一个性质，可使它与脂肪分离。卵磷脂可与蛋白质、糖及金属盐（如氯化镉、氯化钙、氯化锌、胆汁盐等）形成络合物。

四、实验方法与步骤

1. 取鸡蛋2只，分离出卵黄，称重，记录重量，约W1克。

2. 蛋黄放入一个小烧杯内，加入200毫升浓度为95％的乙醇溶液，充分搅碎卵黄，室温提取2小时，过滤。

3. 滤液减压蒸馏回收酒精，浓缩至原体积的1/3（约70毫升）。

4. 浓缩液加氯化锌溶液（1%蛋黄重的氯化锌溶于少量水），沉淀析出，离心分离。

5. 沉淀用丙酮洗涤，至白色蜡状。五氧化二磷真空干燥，称重W2。

6. 计算产率P=W2/W1。

五、实验要求

实验内容要求：（1）取样时尽量不要将蛋白部分带入；（2）提取出的卵磷脂放置时间过长，则呈现褐色。

实验报告要求及考核评价要求：能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论。

六、场地、设备与器材

实验场地：待定

实验设备与器材：磁力搅拌器、旋转蒸发仪、精密天平、真空干燥箱、移液枪、移液管等。

《生化药物制备技术》课程实验项目6

磷脂中含磷量的测定

一、实验目的

掌握磷脂中磷含量测定的原理和方法。

二、实验内容

测定实验5提取出的卵磷脂中磷的含量，根据磷的含量计算卵磷脂提取得率。

三、实验原理

磷脂经提取消化后分解成无机磷酸盐，根据无机磷酸盐与钼铵作用生成磷钼酸铵，再经还原形成钼蓝，在660nm，用分光光度法测定其含量。

四、实验方法与步骤

1、对照品溶液的制备：取以115℃干燥至恒重的无水磷酸氢二钠对照品适量，精密称取，加水溶解至定量稀释制成每1ml含0.04磷的溶液即得。

2、供试品的制备：取实验5提取的卵磷脂约0.03g，精密称定，加25ml氯仿-甲醇（5：1），萃取，过滤。

3、磷标准曲线制备：准确吸取磷标准使用液0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mL，加水至0.3 ml，分别加消化剂0.4 ml ，依次加入4ml显色剂摇匀，70度水浴10分钟后，在分光光度计700nm波长处测定吸光度。以测出的吸光度对磷含量绘制标准曲线。

4、样品测定：取两支试管，一只准确吸取样品测定液0.25 ml，另一只加同量的氯仿-甲醇溶液，分别加消化剂0.4 ml ，电炉上消化至无色，冷却后，都加水0.3 ml ，显色剂4 ml摇匀，70度水浴10分钟，冷却后在分光光度计700 nm波长处测定吸光度。以测出的吸光度在标准曲线上查得未知液中的磷含量。

五、实验要求

实验内容要求：在使用移液管移取溶液时尽量准确，否则会影响实验结果的准确性。

实验报告要求及考核评价要求：能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论。

六、场地、设备与器材

实验场地：待定

实验设备与器材：可见紫外分光光度计、恒温水浴锅、通风橱（或通风柜）、电炉、精密天平、滤纸、擦镜纸等。