《生化技术大实验》课程实验教学大纲

一、课程概况（CourseOverview）

课程名称：生化技术大实验

Course：  Experiment of Biotechnology

课程编号：0081800016适用学生: 生物技术专业

Course Number：0081800016                    Designed for: Biotechnology

学分：0.5学时：18          独立设课：是

Credit：0.5               Class hour:  18        Independent course：yes

预修课程：

Preparatory courses:                     

二、课程简介（Course  Descriptions）

生化技术大实验是生物技术专业课程的重要实践环节。本课程实验的目的首先是训练学生理解生物技术的基本内涵，根据实验要求，结合课堂所学的专业基本知识，自行设计实验内容和路线，培养学生的独立思考能力和科研素养；在实践中提高实验操作技能，以及掌握相关的基本实验和生产技术，从而培养学生分析和解决问题的能力，为学生毕业后从事相关专业打下基础。

The course of Experiment of Biotechnology is offered to the undergraduate students as a base-platform. The main purpose is to deepen the students’ comprehend fundamental conception, principle and theory and develop the students’ ability to analyze and solve problems in their operation. We hope that they may be interested in new advances about bio-engineering and study independently. The concrete contents include in characteristics of biochemical technology, experimental design principles, and a series of technology in common use such as extraction, purification and stand test, for example: Chromatography Technology, Electrophoresis Technology, and Protein Determinations. With practicing the experiments of biochemical technology, the students are able to comprehend and grasp the useful tools in the field of biochemical technology.

三、实验项目一览表(Experiment project schedule)

四、推荐教材及参考书目 (Recommended Teaching Materials and Reference Books)

1.推荐教材

生化实验方法和技术 张龙翔等编 高等教育出版社

Recommended Teaching Materials:

2.参考书目

生物化学实验指导北京大学编人民教育出版社

生物化学实验 陈钧辉等编 科学出版社

Reference Books

五、考核与评价方式(Course Evaluation)

考核方式：考查

Course Evaluation: Evaluation

六、场地、设备与器材(Site, equipment and consumable materials)

场地：12-105，106

设备与器材：

烘箱，电泳仪，电泳槽，分光光度计，冰箱，低温贮存箱，分析天平，低温高速离心机，酸度计，电动搅拌器，真空泵，真空干燥箱，恒流泵，核酸蛋白检测仪，紫外分析仪，记录仪，自动部分收集器，电脑，投影仪，打印机，相机，蒸馏水仪，漩涡混合器，磁力搅拌器，制冰机，摇床，超声波清洗机，吹风机，试剂瓶，滴管，试管，铁架台，铁夹，十字夹，铁圈，试管架，试管夹，纱布，漏斗，移液器，移液器架，移液管，移液管架，玻棒，镊子，培养皿，比色皿，点样器，微量进样器，烧杯，秒表，电炉，钢筋锅，水浴锅，锥形瓶，量筒，离子交换树脂，层析管，PH试纸，碱式滴定管，酸式滴定管，制胶架，注射器，塑料桶，曲线纸，干燥剂，温度计，离心管，枪头，枪头盒。

Equipment and consumable materials

electric cooker,calcination furnace, alytical balance, electric-heated thermostatic water bath, scissors, Kjeldahl flask, volumetric flask, conical beaker, acid burette, muffle, Glass distiller, stirring apparatus, refrigeratory, vacuum-drying oven, precision balance, rotary evaporator, stink cupboard, etc.

撰写人： 杨莉审定人： 

《生物技术大实验》课程实验项目1

血清白蛋白的初步分离、透析

一、实验目的

掌握血清白蛋白粗分离的一般方法。

二、实验内容

　　采用盐析法分离血清白蛋白，并对分离到的血清白蛋白进行透析除盐。

三、实验原理

　　不同蛋白质的相对分子质量、溶解度以及在一定条件下带电的情况有所不同，可根据这些性质的差别，分离及提纯各种蛋白质。

本实验先用盐析法作初步分离。盐析就是大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子的水化膜被剥夺。同时蛋白质分子所带的电荷被中和，因而破坏了蛋白质溶胶的稳定因素，使蛋白质沉淀析出。但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。

在半饱和硫酸铵溶液中，血清白蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后白蛋白主要在上清液中。由于血清白蛋白的相对分子质量较硫酸铵大得多，故盐析初步分离的白蛋白可用透析法或凝胶层析法除去硫酸铵。

四、实验方法与步骤

1、收集血清：取5 ml血液，4 ℃，3,000 rpm离心15 min，用移液枪吸取上清（血清）1 ml至10 ml离心管，留0.1 ml （样1）至1.5 mL离心管，用于测定蛋白质含量和电泳；

2、量筒量取9 ml底液，用移液管逐滴加入，在加的过程中需不断的摇晃或振荡，4 ℃静置2 h；（底液为50 %的饱和硫酸铵溶液）；

3、4 ℃，3,000 rpm离心15 min，收集上清，留0.5 ml至1.5 ml （样2）离心管，用于测定蛋白质含量和电泳；

4、用5%的柠檬酸缓冲液调节pH至4.5（7-9滴，白蛋白的等电点），用量筒确定上清液的体积，计算加入饱和硫酸铵（pH＝4.5）的体积（0.11×V）；

5、逐滴加入饱和硫酸铵（pH＝4.5），边加边振荡，4 ℃静置2 h；

6、4 ℃，3,000 rpm离心20 min，弃上清，沉淀用0.5 ml pH 7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液溶解，留0.1 ml至1.5 ml离心管（样3），用于测定蛋白质含量和电泳；

7、将剩余的0.4 ml蛋白质溶液将透析袋中，放入pH 7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4^＋存在；

8、NH4＋的检测（奈氏试剂检测）：取1 ml透析液，加入5滴奈氏试剂，混匀，观察，如果出现砖红色沉淀，说明仍有NH4＋存在，需继续透析；

五、实验要求

实验内容要求：（1）在制备透析袋时，透析袋中部有不能碰，将两头用棉线扎紧。

实验报告要求及考核评价要求：实验报告及考核评价要求：能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论。

六、场地、设备与器材

场地：12-105，106

设备与器材：

冰箱，低温贮存箱，分析天平，低温高速离心机，酸度计，电动搅拌器，真空泵，真空干燥箱，恒流泵，电脑，投影仪，蒸馏水仪，漩涡混合器，磁力搅拌器，制冰机，摇床，超声波清洗机，试剂瓶，滴管，试管，铁架台，铁夹，十字夹，铁圈，试管架，试管夹，纱布，漏斗，移液枪，移液器架，移液管，移液管架，玻棒，镊子，培养皿，比色皿，烧杯，秒表，电炉，钢筋锅，水浴锅，锥形瓶，量筒，离心管，枪头，枪头盒等。

《生物技术大实验》课程实验项目2

血清白蛋白的纯化

一、实验目的

了解离子交换层析的基本原理；学会用离子交换法分离纯化蛋白质。

二、实验内容

　　离子交换柱安装，平衡，加样，洗脱，样品收集。

三、实验原理

　　不同蛋白质的相对分子质量、溶解度以及在一定条件下带电的情况有所不同，可根据这些性质的差别，分离及提纯各种蛋白质。

在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此之间相反电荷基团的静电吸引，而这又和溶液的pH与盐离子浓度有关。因此，蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中盐离子浓度和pH来完成，对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。

除硫酸铵后的白蛋白溶液在0.02 mol/L pH7.4 醋酸铵缓冲液的条件下，加到二乙氨乙基（DEAE ）－纤维素（阴离子交换纤维素之一）层析柱上，在此pH 时，DEAE 一纤维素带有正电荷，它能吸附带负电荷的白蛋白、α及β球蛋白（血清白蛋白等电点为4 . 9 ，绝大多数。α及β球蛋白等电点均小于6 ）。随着盐离子浓度的提高，离子交换柱上的β－球蛋白、α－球蛋白、白蛋白依次被洗脱下来。

四、实验方法与步骤

1、装柱：将层析柱固定，保持垂直位。将浸胀的DEAE-纤维素装入柱内，至8-10cm高度，平衡过夜；

2、准备60－100支试管，置于自动收集器上；洗脱液经核酸蛋白检测仪监视，调节流速为 1mL/min，蛋白质检测器调零；

3、上样：将透析袋剪开，用移液管转至凝胶面上，待样品进入凝胶后再加入少量缓冲液，使样品完全进入胶内；

4、洗脱：采用连续梯度洗脱。接上恒流泵，用0.02～1.0mol／L醋酸－醋酸铵缓冲液（pH7.4）进行梯度洗脱，收集；记录出现峰值的管号；保存样品；

五、实验要求

实验内容要求：（1）装柱时应注意均匀，凝胶内不得有气泡，凝胶床要平整；（2）整个操作过程中柱子不能干燥，或处于液面之下。

实验报告要求及考核评价要求：实验报告及考核评价要求：能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论。

六、场地、设备与器材

场地：12-105，106

设备与器材：

烘箱，分光光度计，冰箱，低温贮存箱，分析天平，低温高速离心机，酸度计，电动搅拌器，真空泵，真空干燥箱，恒流泵，核酸蛋白检测仪，紫外分析仪，记录仪，自动部分收集器，电脑，投影仪，打印机，相机，蒸馏水仪，漩涡混合器，磁力搅拌器，制冰机，摇床，超声波清洗机，吹风机，试剂瓶，滴管，试管，铁架台，铁夹，十字夹，铁圈，试管架，试管夹，纱布，漏斗，移液器，移液器架，移液管，移液管架，玻棒，镊子，培养皿，比色皿，点样器，微量进样器，烧杯，秒表，电炉，钢筋锅，水浴锅，锥形瓶，量筒，离子交换树脂，层析管，PH试纸，注射器，塑料桶，曲线纸，干燥剂，温度计，离心管，枪头，枪头盒等。

《生物技术大实验》课程实验项目3

血清白蛋白纯度的检测

一、实验目的

学习蛋白质纯度检测方法。

二、实验内容

　　聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质纯度。

三、实验原理

　　凝胶层的不连续性：不连续系统的凝胶包括浓缩胶和分离胶。浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小。在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时遇到的阻力小，移动快。而在小孔胶中泳动时遇到的阻力大，移动慢。因此，在两层凝胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。缓冲液离子成分和pH的不连续性：在两层凝胶中均有Tris和HCl。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH。HCl在一定pH条件下易解离出Cl-，它在电场中迁移率大，走在最前面，故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的甘氨酸在pH8.3的缓冲液中解离度很小，仅为0.1-1%，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子。血清中，大多数蛋白质pI在5.0左右，在pH8.3或6.7时均带负电荷，在电场中均移向正极，其有效迁移率介于快慢离子之间，于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面处，被浓缩成极窄的区带。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后分离成多个区带。此外，电泳体系中电位梯度的不连续性对样品的浓缩和迁移也具有一定作用。

四、实验方法与步骤

1、胶的制备：

2、上样：样品的处理：样品加等量的40%蔗糖溶液再加一滴0.1%溴酚蓝；上样顺序：（1）标准蛋白；（2）样品准备步骤（3）收集的蛋白质溶液；（3）样品准备步骤（6）收集的蛋白质溶液；（4）－（X）：柱层析出现高峰的管号蛋白质；加样量：20μl；

3、电泳：点样端负极，恒压：开始180V，待样品进入分离胶后300V。电极缓冲液：pH 8.3 Tris –Gly电极缓冲液

4、染色：脱色考马斯亮兰R-250，1h。

5、脱色：先用蒸馏水冲洗凝胶，再用脱色液（冰醋酸：蒸馏水：甲醇=75：875：50）脱色1h；

五、实验要求

实验内容要求：（1）正确组装胶槽，防止漏胶；（2）制胶时注意加样准确和正确，防止漏加，和重复加样；（3）制胶时AP和TEMED需最后加，加好需立即倒胶，防止胶的凝固。

实验报告要求及考核评价要求：实验报告及考核评价要求：能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论。

六、场地、设备与器材

场地：12-105，106

设备与器材：

烘箱，电泳仪，电泳槽，冰箱，低温贮存箱，分析天平，酸度计，电动搅拌器，真空泵，真空干燥箱，电脑，投影仪，打印机，相机，蒸馏水仪，漩涡混合器，磁力搅拌器，制冰机，摇床，超声波清洗机，吹风机，试剂瓶，滴管，移液器，移液器架，移液管，移液管架，玻棒，镊子，培养皿，点样器，微量进样器，烧杯，量筒， PH试纸，，制胶架，注射器，塑料桶，干燥剂，温度计，离心管，枪头，枪头盒等。