《分子生物学实验A 》课程实验教学大纲

一、课程概况（CourseOverview）

课程名称：分子生物学实验A

Course：Molecular Biological Experiment

课程编号：0081800007                      适用学生:生物技术

Course Number：0081800007                  Designed for: Biotechnology

学分：1               学时：  36      独立设课：是

Credit：1            Class hour:    36      Independent course：yes

预修课程：分子生物学

Preparatory courses:    Molecular Biology                 

二、课程简介（Course  Descriptions）

分子生物学实验是生物技术专业的一门专业基础课，是为了配合分子生物学的教学而开设的。本课程从DNA、分离、鉴定等方面入手，通过开设DNA 技术、基因表达技术等实验，训练学生掌握分子生物学的基本实验方法和操作技能，使学生掌握分子生物学基本实验设计，实验方法，实验结果分析，使学生进一步巩固和掌握有关分子生物学的基本知识和相关理论。通过实验，培养学生综合运用知识能力，解决实际问题能力和创新能力，培养学生的独立科研能力。

Molecular Biology Expriment is a  basic course for education in biological sciences. It aims to expend student's knowledge in molecular biology. Through the course of DNA extraction and identification.

三、实验项目一览表(Experiment project schedule)

四、推荐教材及参考书目 (Recommended Teaching Materials and Reference Books)

1.推荐教材：《分子生物学实验指导》

Recommended Teaching Materials:

2.参考书目：《分子生物学》

Reference Books

五、考核与评价方式(Course Evaluation)

课堂成绩：

实验结果成绩：

笔试成绩：

总分=课堂× %+实验结果× %+笔试结果× %

撰写人：审定人： 

《分子生物学实验》课程实验项目1

质粒DNA的提取和纯化

一、实验目的

本实验要求掌握最常用的质粒的提取纯化方法。

二、实验内容

使用SDS小量碱法提取和纯化质粒DNA。

三、实验原理

在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。

将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

四、实验方法与步骤

1. 用灭菌的牙签挑取单菌落放入50ml LB液体培养基（含Amp 0.1 mg/ml）中，37℃振荡培养过夜；

2. 将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，10,000 rpm离心30秒，去掉上清液，重复两次；

3. 加入100μL的SolutionI 漂洗沉淀，倒尽液体；

4. 加入200μL 用冰预冷的SolutionI，涡旋使沉淀充分悬浮，室温放置5分钟；

5. 加入200μL SolutionII，混匀（快速颠倒混匀30次，注意动作轻），室温放置2min。

6. 加入150μL用冰预冷的SolutionIII，温和颠倒混匀（注意动作轻），冰浴放置2－5min。

7. 4℃，12,000rpm，离心10min，将上清移至1个新Eppendorf 管中，注意所取体积（约400 μL ）。

8. 加入等体积氯仿:异戊醇（约400 μL ），混匀（注意动作轻）。4℃，12,000rpm，离心10min。

9.取上部水相，转入新的离心管，加入2.5倍体积的无水乙醇（同时加入1/10倍体积的3M醋酸钠，pH5.2），混匀，室温放置10分钟沉淀双链DNA，4℃， 12,000rpm，离心15min 。

10. 弃去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使离心管底部的液体流尽后，加入预冷的0.5ml70%乙醇，漂洗沉淀，4℃，12,000rpm，离心5min，弃去上清液。

11. 加入0.5ml70%乙醇，4℃，12,000rpm，离心5min，弃去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使离心管底部的液体流尽。

12. 每管中加入25μL无菌水，37℃溶解质粒DNA，-20 ℃保存备用。

13．取10μl DNA溶解液用ＴＥ稀释至1000ul测定OD260和OD280,计算OD260/OD2 80之比；

14.  同时以以下公式计算得率。

质粒DNA得率：

稀释倍数×OD260×0.05×50/1.5ml

15．取10μl  DNA溶解液加2μl Loading buffer于1%琼脂糖,电泳3小时,电压40伏。

16．电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察，记录结果。

五、实验要求

实验内容要求、实验报告要求及考核评价要求

１．质粒DNA OD260，OD280的值，由此计算质粒DNA得率和DNA纯度。

２．记录电泳结果并说明结果内容。

3．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及实验中分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。

4．简要叙述酚氯仿抽提DNA体系后出现的现象及其成因。

5．沉淀DNA时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行？

6．实验报告格式

实验目的

实验原理

实验仪器、材料与试剂

实验步骤

实验结果及讨论

六、场地、设备与器材

场地：10幢327

设备：高压灭菌锅、台式高速离心机、核酸真空干燥仪、恒温摇床、超净工作台、移液枪、紫外分光光度计、斡旋震荡器、透射式紫外检测仪、电泳仪、电泳槽等。

器材：培养皿、枪头、离心管、锥形瓶等。

试剂：

ＬＢ培养基：

胰化蛋白胨    10g

酵母提取物     5g        定容           1000ml pH             7.5

NaCl           10g

ＳＴＥ：

0.1M           NaCl

10mM           Tris HCl(pH8.0)

1mM            EDTA

ＡｍＰ      50mg/ml

溶菌酶      10mg/ml (用10mM  Tris·HCl pH8.0新鲜配制）

溶液Ⅰ：

50mM    葡萄糖

25mM    Tris·HCl（pH8.0）

10mM    EDTA

溶液Ⅱ：（新鲜配制）

0.2N    NaOH

1%      SDS

溶液Ⅲ：

5M KAC  10ml

冰醋酸  11.5ml

水      28.5ml

酚，氯仿，乙醇    RNase 琼脂糖

ＴＥ：   10mM    Tris-HCl(pH8.0)    1mM     EDTA

《分子生物学实验》课程实验项目2

DNA酶切和目的片断的回收以及DNA琼脂糖凝胶电泳和紫外检测

一、实验目的

学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方法。

二、实验内容

将DNA酶切并回收目的片段。

将回收的目的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳并在紫外光下检测。

三、实验原理

限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。

琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。

四、实验方法与步骤

1．质粒DNA的酶切（自提质粒）

* 缓冲液随不同的酶而不同，本实验用 H buffer。

置于37℃水浴酶解0.5-1小时。酶解完成后，分别加入10ml 3倍的上样缓冲液，然后各取15ml进行电泳分析。

在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物：

将反应物置于37℃水浴，温浴1～3小时。

加入5 µl加样缓冲液，混匀后即可加样进行电泳。

在紫外观察分析仪上观察酶切的结果。

2．琼脂糖凝胶的制备

琼脂糖凝胶液的制备：称取0.15g琼脂糖，置于三角瓶中，加入15ml TBE或TAE工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。

3．胶板的制备

取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶条(宽约1cm)，将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好梳子。

将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层,然后放入电泳梳。

室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5-1×TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用。

4．加样

用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约5～10 ml。

2 kb DNA ladder（共6条带）：在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入2ml 的 2 kb DNA ladder（50ng/ml）。

5．电泳（带上手套操作）

加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；

建议在100～120V的电压下电泳；

当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停止电泳；

扫胶仪扫胶，拍片保存。

6．观察与拍照

在紫外灯(310nm波长)下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。紫外光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。拍照电泳图谱时，可采用快速凝胶成象系统。

五、实验要求

实验内容要求、实验报告要求及考核评价要求

实验内容要求：掌握DNA酶切和目的片断的回收以及DNA琼脂糖凝胶电泳和紫外检测的相关实验技术和原理。

实验报告要求：

实验报告格式：

实验目的

实验原理

实验仪器、材料与试剂

实验步骤

实验结果及讨论

六、场地、设备与器材

场地：10幢327

实验仪器：

1、微量移液器

2、离心机

3、恒温水浴锅

4、电泳仪

5、电泳槽

6、凝胶成像仪

试剂：

质粒

NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder)

EcoR1 和 Xho1 核酸内切酶（Takara）

EcoR 1和 Xho 1酶解缓冲液(10×H buffer)

琼脂糖

TBE或TAE缓冲液(10×)

溴化乙啶染色液(10mg/ml)

上样液(6×)：0.25%溴酚兰，40％(W/V)蔗糖水溶液或30％的甘油。

《分子生物学实验》课程实验项目3

大肠杆菌感受态细胞的制备

一、实验目的

掌握大肠杆菌感受态细胞的制备原理和技术。

二、实验内容

大肠杆菌感受态细胞的制备与检验。

三、实验原理

由于DNA是亲水性分子，不容易穿过细菌的细胞膜。为了使细菌容易接受外源质粒，必须让它们具有容易接受外源DNA的状态，感受态（competent）。可以让细菌悬在0℃， CaCl2低渗溶液中，这样细胞膜胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的细胞——感受态细胞(Compenent cells)。

四、实验方法与步骤

从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。

将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于50ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

1. 将培养液转入EP管，冰上放置20 min。

2. 4℃离心5 min，4000rpm，弃上清。

3. 加入0.75ml预冷的CaCl₂，悬浮细胞,冰上放置30 min。

4. 4℃离心5 min，4000rpm，弃上清。

5. 加入0.2ml预冷的CaCl₂，悬浮细胞，放4℃保存。

五、实验要求

实验内容要求、实验报告要求及考核评价要求

细胞一旦离开培养基，实验操作要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。

整个实验过程中注意将细胞置于冰上。

要求掌握大肠杆菌感受态细胞的制备原理和技术。

实验报告要求将实验结果打印并附在报告后。

六、场地、设备与器材

试验场地：10幢327

实验仪器：恒温摇床、超净工作台、冷冻离心机、制冰机

实验试剂：大肠杆菌DH5α、LB液体培养基、0.1mol/l CaCl₂溶液

《分子生物学实验》课程实验项目4

质粒DNA转化感受态大肠杆菌

一、实验目的

学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法并掌握其基本原理。

二、实验内容

将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体。

三、实验原理

在转化混合液中，相对于细菌，外源DNA通常是过量的。DNA的结合状态跟游离状态是相互平衡的过程，达到平衡点的时间大约是20分钟。

DNA跟细菌表面的结合不是十分紧密，任何的振动都可能使DNA脱离细菌表面，导致转化效率降低。

热休克使细胞膜通透性增大。

超螺旋的质粒转化效率大于线性质粒。

四、实验方法与步骤

1、取100μL感受态细胞悬液，加入1μL连接产物（重组质粒）（在冰上操作），轻轻摇匀，冰浴20min。

2、42℃水浴中热激90s （或 37℃水浴 5min），热激后迅速置于冰上冷却5min。

3、向EP管中加入1mL  LB液体培养基（不含 Amp），混匀后37℃振荡培养 1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr）。

4、3000 rpm 离心 5min。

5、弃去1ml上清，余下全部样品（约0.1ml），用枪轻轻吹匀，吸至含Amp的筛选平板上，均匀涂布。正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h。

五、实验要求

实验内容要求、实验报告要求及考核评价要求

掌握本实验的基本实验技术与基本原理。

回答如下问题：

如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？

实验报告：

写明实验目的、实验原理、仪器、材料与试剂

详细列出实验步骤

画出实验结果的示意图并做分析。

六、场地、设备与器材

试验场地：10幢327

实验仪器：恒温摇床、超净工作台、冷冻离心机、制冰机、生化培养箱

实验试剂：LB液体培养基（不含Amp）、Amp、LB固体培养基

《分子生物学实验》课程实验项目5

PCR技术

一、实验目的

掌握PCR技术的基本技术与原理。

二、实验内容

将上节实验课的重组质粒进行PCR鉴定。

三、实验原理

是一种根据体内DNA复制原理，在体外扩增DNA的技术。主要用于在体外扩增特异DNA片段，它可以在短时间内在试管中获得百万特异DNA序列拷贝。

四、实验方法与步骤

1. 变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；

2. 退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；

3. 延伸(Extension)：DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，按碱基配对原理，合成一条新的与模板DNA链互补的DNA链。

五、实验要求

实验内容要求、实验报告要求及考核评价要求

掌握本实验的基本实验技术与基本原理。

实验报告：

写明实验目的、实验原理、仪器、材料与试剂

详细列出实验步骤

画出实验结果的示意图并做分析。

六、场地、设备与器材

试验场地：10幢327

实验仪器：PCR仪、超净工作台、制冰机、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、移液枪、超纯水仪、冰箱等

实验试剂：

DNA模板（DNA template）

引物（primer）

引物长度： 15-30bp。

引物 3’端的碱基要求严格配对。

引物内部出现二级结构。

Taq酶（Taq DNA polymerase）

dNTP（ dATP,dGTP,dCTP,dTTP ）

Mg²⁺（magnesium）

为DNA聚合酶活性所必需。

浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

Mg²⁺浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增。

《分子生物学实验》课程实验项目6

真核基因在原核细胞中的表达

一、实验目的

了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。

二、实验内容

将外源基因导入原核细胞，使其在原核细胞中表达，并对表达的蛋白进行检测。

三、实验原理

外源基因克隆在含有lac启动子的表达系统中。先让宿主菌生长，lac I产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合抑制下游的外源基因转录。向培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代-b-D-半乳糖），解除抑制使外源基因大量表达。表达的蛋白可经SDS-PAGE或Western-blotting检测。

四、实验方法与步骤

（一）诱导表达

1. 将含有pET32和pET32重组子的BL21菌落分别接种于10ml含氨卞青霉素（50μg/ml）的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。（第一天）

2. 测OD600达1.2左右，取出1ml样品作为IPTG诱导前的样品1；然后分别取100μl培养液（2%的接种量）于5ml氨卞青霉素（50μg/ml）的LB培养基中，分别在37 ℃培养0.5小时左右。

3. 各取出1ml样品作为IPTG诱导前的样品2。

4. 在剩余样品中添加IPTG，终浓度为1mM，继续震荡培养。

5. 分别在1、2、3、5小时后取出1.0ml样品作为IPTG诱导后的样品。

6. 所有样品5000rpm 离心 5min，分别回收它们的上清与沉淀，做好标记，-20℃保存。（第二天）

（二）SDS-PAGE（第三天）

1. 上清样品各30μl，添加10μl的4×SDS loading buffer，混匀。

2. 沉淀中加入200μl pH7.4的PBS缓冲液洗涤，5000rpm离心5min。重复两次。

3. 加入30μlpH7.4的PBS缓冲液，10μl的4×SDS loading buffer，在漩涡混合器上剧烈震荡1min,使菌体完全溶菌。

4. 将上述样品分别在100℃沸水浴中保持5min，立即放入冰浴中冷却。

5. 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；

6. 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，装好玻璃板；

7. 按如**积配制10％分离胶7.5 ml，混匀；　　

8. 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；
9. 按如**积配制5％浓缩胶3.0 ml，混匀；

10. 滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；凝胶约30min。

11. 装好电泳系统，加入1X电极缓冲液，使胶的上端和下端均浸泡在缓冲液中。轻轻拔掉梳子。

12．在泳道内分别用微量移液器或注射器添加标准蛋白和样品。上样20μl。

13. 接通电源. 上负下正，其始电流20mA，电压70-80V，待溴酚蓝刚跑进分离胶时，电流30mA，稳压150V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～3hr。

14. 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2 hr；加入脱色液，置于80 rpm脱色摇床上,每20 min更换一次脱色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸馏水）至完全脱净。。

１5. 拍照。

五、实验要求

实验内容要求、实验报告要求及考核评价要求

掌握本实验的基本实验技术与基本原理。

实验报告：

写明实验目的、实验原理、仪器、材料与试剂

详细列出实验步骤

画出实验结果的示意图并做分析。

六、场地、设备与器材

试验场地：10幢327

实验仪器：微量移液器、微量离心管架、台式冷冻离心机、制冰机、恒温摇床、分光光度计、超净工作台、恒温培养箱、电泳仪、垂直电泳槽、脱色摇床、电热炉、试管、三角烧瓶、接种环、移液器吸头、50ml 微量离心管、1.5ml 微量离心管等

实验试剂：

1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。

2. 30%凝胶母液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。

3. pH8.9分离胶缓冲液：Tris 36.3g，加重蒸水80ml使其溶解，加1mol/L HCl 14ml，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。

4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g，加重蒸水80ml使其溶解，加1mol/L HCl调pH6.7，定容至100ml，4℃保存。

5.TEMED（四乙基乙二胺）原液，4℃保存。

6. 10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制），4℃保存。

7.10X Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，SDS10g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。

8. 考马斯亮蓝R250染色液：称1g考马斯亮蓝R250，甲醇500ml，冰醋酸100ml，定容1L。

9. 脱色液：10 ml 冰乙酸；45 ml甲醇；45 ml蒸馏水。

10. IPTG: 1Mm。

《分子生物学实验》课程实验项目7

RACE扩增

一、实验目的

学习和了解RACE扩增特异基因的实验原理和步骤

二、实验内容

    RACE技术基础操作。

三、实验原理

RACE全名rapid amplification of cDNA ends，快速扩增cDNA末端方法

RT-PCR的全名是Reverse Transcriptase PCR （反转录酶PCR），其技术原理简单的来说是将一段待测的RNA序列经反转录酶的作用转录成cDNA，再利用PCR技术将基因片段以几何级数倍增的方式增加到数十万倍的方法。

3’RACE技术是在反转录酶的作用下，以连有可以和polyA配对的oligo(dT)的锚定引物（Adapter primer, AP)启始cDNA第一条链的合成。用RNaseH 降解模板mRNA。用锚定引物和基因片段内部特异引物(GSP1）进行PCR扩增得到目的3‘片段

四、实验方法与步骤

第一步（逆转录反应）

第二步 3‘ RACE PCR反应

第三步 3‘ RACE PCR反应，在PCR仪上设置下列程序：

Ü94 1min

Ü94 30 sec

Ü50 30 sec

Ü72 30s

Ü72 10

第四步 PCR结果的琼脂糖电泳检测

|配制琼脂糖凝胶

|上样

|电泳检测

五、实验要求

实验内容要求、实验报告要求及考核评价要求

掌握本实验的基本实验技术与基本原理。

实验报告：

写明实验目的、实验原理、仪器、材料与试剂

详细列出实验步骤

画出实验结果的示意图并做分析。

六、场地、设备与器材

试验场地：10幢327

实验仪器：PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、制冰机、超纯水仪、微量移液器等

实验试剂：PCR技术全部试剂（同实验5）