《环境微生物学实验》课程实验教学大纲

一、课程概况（Course Overview）

课程名称：环境微生物学实验

Course：

课程编号适用学生:环境科学学生

Course Number：                  Designed for:

学分：1               学时：36           独立设课：是

Credit：1               Class hour:36        Independent course：yes

预修课程：环境工程微生物学

Preparatory courses:

二、课程简介（Course  Descriptions）

本课程是依据环境微生物学的基本内容设计的实验。实验内容主要分三部分：第一部分学习环境中微生物主要类群的观察方法，第二部分学习实际应用中微生物的观察及计数方法，第三部分为微生物处理工艺的参观学习。通过实验教学，使学生了解正常环境和污染环境中微生物的主要类群及其生理、生态特性，掌握相应的基本操作技能，培养学生分析问题和解决问题的能力以及实事求是、严肃认真的科学作风。

三、实验项目一览表(Experiment project schedule)

四、推荐教材及参考书目 (Recommended Teaching Materials and Reference Books)

1.推荐教材：郑平、、、、、、

  Recommended Teaching Materials:

2. 参考书目：

王家玲主编，《环境微生物学实验》，北京，高等教育出版社，1988

沈萍等编，《微生物学实验》，高等教育出版社，2002

黄秀梨主编《微生物学实验》，高等教育出版社，2002

肖琳, 杨柳燕, 尹大强, 张敏跃主编.环境微生物实验技术（第1版）. 北京：中国环境科

学出版社, 2004

周群英, 高延耀编著. 环境工程微生物学（第2版）. 北京: 高等教学出版社, 2000

Reference Books

五、考核与评价方式(Course Evaluation)

实验考核方式应根据：①平时实验情况及实验报告内容；②实验考试进行评分。

评分方法：平时成绩和实验报告占70％，实验考试占30％。

撰写人：审定人：

《环境微生物实验》课程实验项目

实验一 土壤中细菌的分离与纯化

一、实验目的

  1、掌握倒平板的方法。

  2、学习从土壤中分离细菌的方法。

  3、练习无菌操作技能,掌握接种纯化方法。

  4、观察、了解、描述细菌的菌落特征与计数方法。

二、实验内容

学习土壤细菌的分离、纯培养方法，学习无菌操作技术

三、实验原理

从不同分离源混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。土壤是微生物的大本营，含有极其丰富的微生物，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

四、实验方法与步骤

本实验采用稀释涂布平板法分离土壤中的细菌。

 1、制备土壤稀释液：

（1）采样取表层以下5-10cm处的土样，放入灭菌袋，带回实验室备用。

（2）制备稀释液

    A．称取土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将细胞分散，少待沉淀，取上清液使用。

    B．用一支1ml或0.5ml无菌吸管吸取0.5ml土壤悬液加入盛有4.5ml无菌水的试管中充分混匀，然后用另一无菌吸管从此试管中吸取0.5ml加入另一盛有4.5ml无菌水的试管中，吸管在试管中吸放冲洗3次，可持续使用以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 、10-7等不同稀释度的土壤液。

    C．每组两人取6支试管，每支试管先加4.5mL无菌水。

2、倒平板

培养基加热熔化，待冷至55~60℃时倒平板，每组倒四个皿。水平放置，凝固成平板。

 3、涂布

吸取菌液0.1ml（用0.1mL—0.2mL移液管，或用移液管或移液枪）注入培养皿，均匀涂布。

4、培养 

将牛肉膏蛋白胨培养基平板倒置于37℃培养箱中培养1~2d。

5、菌落计数、特征描述与纯化培养

（1）菌落观察与计数：描述菌落特征，选培养皿中有30-300个菌落，计数比较准确。

（2）接种纯化：选择一个菌落（取菌落较大的），记录菌落特征。然后挑取少许细胞接种到试管斜面上（之字形划线），经37℃培养。待菌苔长出后，检查菌苔特征是否均匀一致，初步确定是否是单一的微生物。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

 6、菌落计算方法
分别数出两个稀释度下的菌落数（单位：cfu=colony form unit）。换算成单位质量土壤的细菌数（cfu/g）。

五、实验要求

实验内容要求、实验报告要求及考核评价要求

1、由指导教师讲清实验基本原理、基本操作方法；

2、认真进行实验，观察、记录实验结果；

3、写出实验的报告。报告应分析实验结果，讨论实验中出现或存在的问题。

4、实验报告必须包括：①实验原理；②仪器；③方法和结果；④分析与讨论。

5、实验考核方式应根据：①平时实验情况及实验报告内容；②实验考试进行评分

六、场地、设备与器材

场地：微生物学实验室

仪器设备：平板，锥形瓶，移液管，接种环，显微镜

实验二油镜的使用和细菌的一般染色法

一、实验目的

1、学习并掌握油镜的使用。

2、了解革兰氏染色原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

3、学习、掌握革兰氏染色法。

二、实验内容

学习油镜的使用、细菌的制片技术以及简单染色、革兰氏染色的原理和方法

三、实验原理

 1、细菌的简单染色法

 2、细菌的革兰氏染色法

四、实验方法与步骤

本实验采用革兰氏染色法。

    1、制片：涂片→干燥→固定

    2、初染：滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）→染色1~2min→水洗。

    3、媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。

    4、脱色：将玻片倾斜，在白色的背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。

五、实验要求

实验内容要求、实验报告要求及考核评价要求

1、由指导教师讲清实验基本原理、基本操作方法；

2、认真进行实验，观察、记录实验结果；

3、写出实验的报告。报告应分析实验结果，讨论实验中出现或存在的问题。

4、实验报告必须包括：①实验原理；②仪器；③方法和结果；④分析与讨论。

5、实验考核方式应根据：①平时实验情况及实验报告内容；②实验考试进行评分

六、场地、设备与器材

场地：微生物学实验室

仪器设备：酒精灯、载玻片、显微镜

实验三细菌的荚膜、芽孢、鞭毛染色法染色

一、实验目的

    1、学会显微镜油镜的使用和保护方法。

  2、认识细菌的基本形态和特殊结构。

  3、掌握革兰氏染色方法。

二、实验内容

学习细菌的特殊构造荚膜、芽孢、鞭毛的制片、染色的原理及操作技术

三、实验原理

  1、芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。

    2、用衬托染色法染色法，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体周围形成一透明圈。

    3、在染色前先用媒染剂处理，使它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色

四、实验方法与步骤

衬托染色法染色法、湿墨水法、硝酸银染色法。

1、制片→染色→水洗→复染→水洗→镜检

2、滴碳素墨水→加一滴蒸馏水→镜检

3、制片→染色→镜检

五、实验要求

实验内容要求、实验报告要求及考核评价要求

1、由指导教师讲清实验基本原理、基本操作方法；

2、每人单独进行实验，观察、记录实验结果；

3、写出实验的报告。报告应分析实验结果，讨论实验中出现或存在的问题。

4、实验报告必须包括：①实验原理；②仪器；③方法和结果；④分析与讨论。

5、实验考核方式应根据：①平时实验情况及实验报告内容；②实验考试进行评分

六、场地、设备与器材

场地：微生物学实验室

仪器设备：酒精灯、载玻片、显微镜、镊子、琼脂斜面培养物，染色液有结晶紫、碘液、95％酒精、稀释石炭酸番红

实验四丝状微生物的形态观察

一、实验目的

    1、学习放线菌的插片接种法；掌握观察放线菌和霉菌的基本方法；了解常见霉菌种类的基本形态特征。

    2、观察放线菌和霉菌在显微镜下的区别。

二、实验内容

观察放线菌、霉菌菌落特征和个体形态特征，并比较各类菌丝的异同

三、实验原理

放线菌菌落质地硬而且致密，菌落小而不广泛延伸；菌落表面呈紧密的绒状或坚实、干燥多皱；霉菌菌落较疏松，外观干燥，不透明，呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状，菌落表面常呈不同结构和色泽特征。

四、实验方法与步骤

本实验采用插片法

1、插片培养放线菌3-5天后，在显微镜下观察放线菌形态。

2、在载玻片上加一滴蒸馏水，用镊子从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，放到蒸馏水滴中，用接种针小心地将菌丝挑开（如孢子较多，可先置于50%酒精或蒸馏水中洗去）。盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。

五、实验要求

实验内容要求、实验报告要求及考核评价要求

1、由指导教师讲清实验基本原理、基本操作方法；

2、每人单独进行实验，观察、记录实验结果；

3、写出实验的报告。报告应分析实验结果，讨论实验中出现或存在的问题。

4、实验报告必须包括：①实验原理；②仪器；③方法和结果；④分析与讨论。

5、实验考核方式应根据：①平时实验情况及实验报告内容；②实验考试进行评分

六、场地、设备与器材

场地：微生物学实验室

仪器设备：酒精灯、载玻片、盖玻片、显微镜、镊子、接种针

实验五酵母菌的加富培养与分离

一、实验目的

    1、学习特定微生物的富集分离培养技术。

    2、观察酵母菌的菌落、个体形态及出芽方式。

二、实验内容

学习环境特定微生物的富集培养分离技术，观察酵母菌的形态，区分死活细胞并观察酵母菌的出芽繁殖方式

三、实验原理

酵母菌常见于含糖分较高的环境中，用酸性液体培养基获得酵母的加富培养，然后在固体培养基上用划线法分离。

四、实验方法与步骤

本实验采用划线分离法

    1、分装：将乳酸马铃薯葡萄糖培养液分装至试管中(每人2支)。

    2、接种：取一小块苹果果皮，不需冲洗，直接加入其中1支乳酸马铃薯葡萄糖培养液试管中，置28-30℃，培养48小时，可见此液体培养基变浑浊。

    3、加富培养：用无菌吸管取上述条件下培养后的培养液0.1ml，注入另1支乳酸马铃薯葡萄糖培养液试管中，置28-30℃再培养24小时

    4、分离：（星期日做）。马铃薯葡萄糖琼脂培养基熔化后制成平板。用划线法分离上述加富培养液中的酵母菌， 28-30℃培养。

五、实验要求

实验内容要求、实验报告要求及考核评价要求

1、由指导教师讲清实验基本原理、基本操作方法；

2、每人单独进行实验，观察、记录实验结果；

3、写出实验的报告。报告应分析实验结果，讨论实验中出现或存在的问题。

4、实验报告必须包括：①实验原理；②仪器；③方法和结果；④分析与讨论。

5、实验考核方式应根据：①平时实验情况及实验报告内容；②实验考试进行评分

六、场地、设备与器材

场地：微生物学实验室

仪器设备：酒精灯、接种针、洁净试管、无菌吸管、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、苹果果皮

实验六微生物计数及大小的测定

一、实验目的

    1、掌握使用血细胞计数板进行细胞计数的原理及方法。

    2、学习并掌握显微测微尺测定微生物大小的原理和方法。

二、实验内容

学习并掌握血球计数板直接计数法和显微测微尺测定微生物大小的方法

三、实验原理

血细胞计数板：是一块特制的载玻片，其上有四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。

微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定需借助测微尺---目镜测微尺和镜台测微尺。

四、实验方法与步骤

本实验采用血球板计数法。

（一）1、菌悬液制备：

做好已知稀释倍数的细菌悬浮液。

      2、镜检计数室：

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。

      3、加样品

在血细胞计数板上盖上盖玻片，沿盖玻片边缘(凹槽）滴加菌液，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室。取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。

（二）1、装目镜测微尺(换目镜)

       2、校正目镜测微尺

   (1）放镜台测微尺   (2）校正    (3）计算

       3、菌体大小测定

五、实验要求

实验内容要求、实验报告要求及考核评价要求

1、由指导教师讲清实验基本原理、基本操作方法；

2、每人单独进行实验，观察、记录实验结果；

3、写出实验的报告。报告应分析实验结果，讨论实验中出现或存在的问题。

4、实验报告必须包括：①实验原理；②仪器；③方法和结果；④分析与讨论。

5、实验考核方式应根据：①平时实验情况及实验报告内容；②实验考试进行评分

六、场地、设备与器材

场地：微生物学实验室

仪器设备：血细胞计数板、盖玻片、测微尺

实验七微生物对有机物的降解与转化

一、实验目的

1、了解微生物对大分子物质水解的原理和方法。
     2、鉴定未知菌对淀粉、蛋白质、脂肪等的水解能力。

二、实验内容

观察微生物对不同大分子物质淀粉、蛋白质、油脂、牛奶等的降解能力

三、实验原理

微生物通过产生的胞外酶将大分子物质分解、吸收和利用。

淀粉酶：淀粉→→糊精、双糖和单糖；

脂肪酶：脂肪→→甘油、脂肪酸；

蛋白酶：蛋白→→氨基酸等。

四、实验方法与步骤

1、淀粉水解实验

（1）将固体淀粉培养基熔化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。（1皿/人）

（2）用记号笔在平板底部分成二部分，分别写上菌名（未知菌和枯草杆菌）。

（3）划线接种，将平板倒置在37℃温箱中培养24h。

（4）观察细菌的生长情况，将平板打开盖子，滴入少量Lugol’s碘液于平皿中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。

（5）观察有无透明圈及透明圈的大小。

2、明胶水解实验

（1）取明胶培养基试管，用记号笔标明欲接种的菌名。（3支/2人，对照菌：枯草杆菌）

（2）用接种针分别穿刺接种。

（3）将接种后的试管置23℃中，培养2d。

（4）观察明胶液化情况。

3、油脂水解试验

（1）将熔化的培养基冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。(1皿/人)

（2）用记号笔在平板底部分成二部分，分别写上菌名。

（3）划线接种。(枯草杆菌、未知菌）

（4）将平板倒置在37℃温箱中培养24h。

（5<, SPAN style='FONT-FAMILY: 宋体; mso-hansi-font-family: Times New Roman; mso-ascii-font-family: Times New Roman'>）取出平板，观察菌苔颜色

4、石蕊牛奶试验

（1）取石蕊牛奶培养基试管，分别标上菌名(3支/2人)。

（2）分别接种。 (枯草杆菌、未知菌）

（3）将接种后试管置于35 ℃培养箱中，培养24~48h。

（4）观察培养基颜色变化。

五、实验要求

实验内容要求、实验报告要求及考核评价要求

1、由指导教师讲清实验基本原理、基本操作方法；

2、每人单独进行实验，观察、记录实验结果；

3、写出实验的报告。报告应分析实验结果，讨论实验中出现或存在的问题。

4、实验报告必须包括：①实验原理；②仪器；③方法和结果；④分析与讨论。

5、实验考核方式应根据：①平时实验情况及实验报告内容；②实验考试进行评分

六、场地、设备与器材

场地：微生物学实验室

仪器设备：固体淀粉培养基、明胶培养基试管、石蕊牛奶培养基试管、接种针、Lugol’s碘液

实验八环境因子对微生物生长的影响

一、实验目的

了解并掌握化学因素、pH值、渗透压对微生物生长的影响

二、实验内容

渗透压、pH、化学物质等不同环境条件对微生物生长的影响

三、实验原理

1、不同化学消毒剂对微生物的影响不同。

     2、在等渗溶液中，微生物正常生长繁殖；在高渗溶液（例如高盐、高糖溶液）中，细胞失水收缩；在低渗溶液中细胞吸水膨胀。

     3、不同微生物对pH条件的要求各不相同，它们只能在一定的pH范围内生长。

四、实验方法与步骤

（一）1、将已灭菌并冷至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌平皿中，水平放置待凝固。（每人1皿）

        2、用无菌吸管吸取0.1mL的菌悬液加入到上述平板中，用无菌三角涂棒涂布均匀。

        3、将已涂布好的平板底皿划分成5等份，每一等份内标明一种消毒剂的名称。

        4、用无菌镊子将已灭菌的小圆滤纸片（D5mm）分别浸入装有各种消毒剂溶液的试剂瓶中浸湿。

        5、将上述贴好滤纸片的含菌平板倒置于37℃温室中，24h后取出观察抑（杀）菌圈的大小。

（二）1、将含不同浓度0、2.5、5.0、10%NaCl的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基熔化、倒平板。（2人4皿）

       2、在已凝固的平板皿底用记号笔划成二部分，分别标记，（用画线法接种，两位同学各接一边。）

       3、将上述平板置于37℃温室中，1d后观察并记录含不同浓度NaCl的平板上细菌的生长状况

（三）1、无菌操作吸取5mL不同pH（3、5、7、9、11）的牛肉膏蛋白胨液体培养基于无菌试管中。（每人各5支）

        2、接种：每支试管分别接入待鉴定细菌0.1ml。

        3、培养：5支试管置于37℃培养箱保温24h。

        4、观察记录：将上述试管取出，观察细菌生长状况（混浊程度）。

五、实验要求

实验内容要求、实验报告要求及考核评价要求

1、由指导教师讲清实验基本原理、基本操作方法；

2、每人单独进行实验，观察、记录实验结果；

3、写出实验的报告。报告应分析实验结果，讨论实验中出现或存在的问题。

4、实验报告必须包括：①实验原理；②仪器；③方法和结果；④分析与讨论。

5、实验考核方式应根据：①平时实验情况及实验报告内容；②实验考试进行评分

六、场地、设备与器材

场地：微生物学实验室

仪器设备：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、小圆滤纸片、无菌吸管、无菌三角涂棒、无菌镊子、无菌试管
实验九水中大肠菌群的检测

一、实验目的

    1、了解水中大肠菌群检测的原理和意义。

    2、学习水中大肠菌群检测的方法

二、实验内容

用多管发酵法测定水中细菌总数和水中总大肠菌群数

三、实验原理

生活用水的水源常被生活污水或工业废水或人与动物的粪便污染。粪便污物含有不同类型的微生物，有腐生性和病原性。水源被粪便污染，就可能引起肠道传染病甚至流行病，因此生活用水及其水源水一般都需要采用细菌学的检验方法来评判水质的微生物污染程度。

四、实验方法与步骤

    1、初发酵实验

2、平板分离

3、复发酵试验

五、实验要求

实验内容要求、实验报告要求及考核评价要求

1、由指导教师讲清实验基本原理、基本操作方法；

2、每人单独进行实验，观察、记录实验结果；

3、写出实验的报告。报告应分析实验结果，讨论实验中出现或存在的问题。

4、实验报告必须包括：①实验原理；②仪器；③方法和结果；④分析与讨论。

5、实验考核方式应根据：①平时实验情况及实验报告内容；②实验考试进行评分

六、场地、设备与器材

场地：微生物学实验室

仪器设备：杜氏小管、乳糖蛋白胨发酵管、接种环、伊红美蓝培养基

十实验考试

一、实验考试目的：主要考查学生对环境微生物实验的基本原理、基本技能掌握的程度。

二、考试内容：（一）实验笔试

（二）实验操作