《细胞生物学实验》课程实验教学大纲

一、课程概况（CourseOverview）

课程名称：细胞生物学实验

Course：Experiment of Cell Biology

课程编号：0081800042适用学生:生物科学、生物技术

Course Number：0081800042Designed for: Bioscience, Biotechnology

学分：1              学时：36           独立设课：是

Credit：1 Class hour: 36         Independent course：yes

预修课程：《细胞生物学》、《植物学实验》、《动物学实验》

Preparatory courses: Cell Biology, Experiment of Botany, Experiment of Zoology 

二、课程简介（Course  Descriptions）

细胞生物学是在显微水平、亚显微水平和分子水平三个层次上探讨细胞生命活动的课程，它是生物学很多分支学科和分子生物学的会合点，是在实验观察基础上建立起来的一门学科。细胞生物学实验的教学目的就是使学生通过实验掌握细胞生物学实验的基本原理、基本方法与技术，巩固和加深对课堂理论知识的理解，同时培养学生独立进行科学研究的基本技能，提高学生的动手能力及分析问题、解决问题的能力，养成实事求是、严格、严密的科学作风。

Experiment of Cell Biology is one course which make students understand the fundamental principle, basic approach and techniques through experiment, consolidate and deepen to understand speculative knowledge of Cell Biology, cultivate students the ability of hands-on skill, parsing problem, and dealing with problems, cultivate students the realistic, hard and fast, rigorous scientific attitudes.

三、实验项目一览表(Experiment project schedule)

四、推荐教材及参考书目 (Recommended Teaching Materials and Reference Books)

1.推荐教材

王金发主编．《细胞生物学实验教程》，科学出版社

Recommended Teaching Materials:

2.参考书目

李素文主编. 《细胞生物学实验指导》教材，高等教育出版社

杨汉民主编．《细胞生物学实验》（第二版），高等教育出版社

Reference Books

五、考核与评价方式(Course Evaluation)

考核方式：考查

Course Evaluation: Evaluation

六、场地、设备与器材(Site，equipment and consumable materials)

场地：12-214, 216

所用设备与器材：

普通光学显微镜、荧光显微镜及显微图像分析系统、相差显微镜、倒置显微镜、扫描电子显微镜、透射电子显微镜、高速离心机、高速冷冻离心机、低速离心机、移液枪、微量进样器、恒温水浴锅、控温摇床、烘箱、冰箱、超净工作台、二氧化碳培养箱、光照培养箱、电泳仪、电泳槽、PCR仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、高压灭菌锅、细胞融合仪、酸度计、渗透压测定仪、细胞分散器、细胞分离器、细胞计数器、通风橱等。

Site: 12-214, 216

Equipment and consumable materials:

light microscope, fluorescent microscope, phase contrast microscope, inverted microscope, scanning electronic microscope, transmission electron microscope, supercentrifuge, high speed freezing centrifuge, conventional centrifuge, liquid-transfering gun, microsyringe, thermostat water bath, thermostat table concentrator, vacuum baking oven, refrigerator, superclean bench, CO₂ incubator, illumination incubator, electrophoresis apparatus, PCR instrument, ultraviolet spectrophotometer, analyzing instrument of formation of image of gel, pressure vapour sterilizer, cell fusion apparatus, pH meter, osmotic pressure apparatus, cell dispersing apparatus, cell sorter, cell counter, stink cupboard, etc.

撰写人：杨莉审定人：

《细胞生物学实验》课程实验项目1

抗体的制备技术及效价检测

一、实验目的

本实验为单克隆抗体技术的免疫阶段，为单克隆抗体技术提供免疫淋巴细胞。了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术，掌握双向免疫扩散法测定抗体的效价。

二、实验内容

小鼠抗体的制备及效价检测。

三、实验原理

机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫和细胞免疫的过程。一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构---抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。当上述两个条件具备时，抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。

完全福氏佐剂的使用能够延长抗原在体内的存留时间，增加可溶性抗原的免疫性。通常制备抗体时常用完全福氏佐剂加强免疫。

抗原、抗体在合适的浓度和比例条件下，抗原和其相应的抗体在有固相支持的液相环境中各自发生扩散。分子双向扩散接触时形成肉眼可见的沉淀线反应。抗体的效价即时指与固定浓度的抗原发生沉淀反应时所需的最小抗体浓度。

四、实验方法与步骤

1、动物的选择：选择2-3个月以上的小鼠，作好标号，分笼饲养。

2、抗原的选择：将抗原（纤维素酶）稀释为4 mg/ml，即可与佐剂混合制成乳剂用于动物免疫。

3、佐剂和抗原乳剂的制备：佐剂（完全福氏佐剂）：轻矿物油（石腊油）8.5 ml；羊毛脂1.5 ml；灭活结核杆菌10 mg。抗原乳剂制备（1）油剂：矿物油和羊毛脂按比例混合，高压8磅20分钟灭菌后作为油剂，使用前微火融化；（2）水剂：灭活结核杆菌1 mg/ml + 抗原4 mg/ml （均为终浓度）。（3）油剂和水剂1：1混合。混合方式：研磨或者注射器混合。

4、免疫方法：小鼠背部皮下多点注射，每点0.1ml。

第一次免疫：实验组小鼠加佐剂的抗原：A组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液；B组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml加佐剂的抗原乳剂。

第二次免疫：第3周实验组小鼠不加佐剂抗原：A组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液；B组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml 2mg/ml纤维素酶液。

第三次免疫：同第二次免疫。

第四次免疫：同第二次免疫。

5、抗血清的制备：第四次免疫一周后，乙醚麻醉小鼠，眼眶取血或心脏取血。收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下析出血清，离心，4000rpm，10min。在无菌条件，吸出血清，分装（0.05～0.2ml），贮于-40℃以下冰箱，或冻干后贮存于4度冰箱保存。

6、抗体的效价检测：双向免疫扩散法检测抗体效价。

琼脂凝胶板的制备：胶布包围一片载玻片使之形成不透水的槽。用生理盐水加热溶解琼脂配成1%溶液，均匀浇注于玻片内。注意勿产生气泡，琼脂厚度约2.5mm。待琼脂凝固后，用去尖头的吸头（直径约为3-4mm）在凝胶上打孔，孔间距为3-5mm。在小孔中加少量加热的液体琼脂，防止渗漏。打孔样式为梅花样，如图：

加样：加样于孔内，左中间孔为抗原；右中间孔为无关抗原（牛血清白蛋白，加满为止）。

结果观察：加样完毕，将琼脂板平放于湿盒内，在室温或37℃扩散18-24小时后观察结果。

五、实验要求

实验内容要求：（1）每组要求注射同一只小鼠；（2）在注射过程中，不要弄死小鼠；尽量选择淋巴较多的部位，增加小鼠产生抗体能力；（3）免疫后小鼠取血时，尽量让血取在离心管中；（4）效价分析打孔中，孔不要漏底。

实验报告及考核评价要求：能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论。

六、场地、设备与器材

实验场地：待定

实验设备与器材：鼠笼、高压灭菌锅、离心机、冰箱、烘箱、自动搅拌器、电泳仪、电泳槽、移液枪、微量进样器、恒温水浴锅等。

《细胞生物学实验》课程实验项目2

植物细胞骨架的观察

一、实验目的

掌握考马斯亮蓝R250对植物细胞骨架染色的方法；通过对洋葱内表皮细胞的处理，掌握植物细胞骨架的制备方法与显微形态观察。

二、实验内容

植物细胞骨架的观察。

三、实验原理

细胞骨架（cytoskeleton），是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、微管和中等纤维。细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号转导和细胞分裂等有重要的作用。

当用适当浓度的去垢剂Triton x-100处理时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质破坏，但细胞骨架系统的蛋白质却被保存，后者用考马斯亮蓝R250染色，可在光学显微镜下观察到细胞骨架的网状结构。

四、实验方法与步骤

1、取一青霉素瓶，加1/2体积pH6.8磷酸缓冲液，将洋葱内表皮（1cm×0.6cm，每瓶放3片）置于青霉素瓶中，使其湿润下沉；

2、去磷酸缓冲液，加1/2体积1% Triton x-100处理20分钟；

3、去Tritonx-100，用M-缓冲液洗3次，每次10分钟；

4、3 %戊二醛固定30分钟；

5、用pH6.8磷酸缓冲液洗3次，每次10分钟；

6、置载玻片上，滴加考马斯亮蓝，染色3分钟；

7．加盖玻片，显微镜观察。

五、实验要求

实验内容要求：（1）取洋葱内表皮时不可带茎肉，样本要尽量展开、铺平；（2）本实验所用试剂气味较重，尽量在通风口操作

实验报告及考核评价要求：能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论；需正确标注所观察组织的具**置。

六、场地、设备与器材

实验场地：待定

实验设备与器材：移液枪、移液管、显微镜、载玻片、盖玻片、自动搅拌器、通风橱等

《细胞生物学》课程实验项目3

酸性磷酸酶在细胞中的定位与分布

一、实验目的

掌握酸性磷酸酶的显示方法；观察酸性磷酸酶在细胞内的分布情况。

二、实验内容

酸性磷酸酶在细胞中的定位与分布。

三、实验原理

酸性磷酸酶分解磷酸脂而释放出磷酸基。在pH 5.0的环境中，磷酸基与铅盐反应形成磷酸铅。但磷酸铅是无色的，所以再与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀，由此就能显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。

四、实验方法与步骤

1、取2个青霉素瓶，加1/2体积10%中性****液，将洋葱内表皮（1cm×0.6cm每瓶放3片）沉于溶液中，4℃下固定30分钟（置冰箱贮藏室），对照实验置50℃烘箱中；

2、去****液，自来水漂洗5分钟（青霉素瓶水加满，换3次）；

3、去水，加酸性磷酶作用液，室温下置30分钟（加液至青霉素瓶1/3体积）；

4、去作用液，自来水漂洗5分钟（青霉素瓶水加满，换3次）；

5、去水，加1%硫化铵处理3分钟（加液至青霉素瓶1/3体积）；

6、去硫化铵，加水漂洗（青霉素瓶水加满，换1次）；

7、置载玻片上，加盖玻片。

8、显微镜观察（注意液泡中标黑色的小颗粒，表示有酸性磷酸酶的活力）。

五、实验要求

实验内容要求：（1）固定时需准确计时；（2）硫化铵处理时间不宜太长，以免破坏细胞结构和形态；（3）本实验所用试剂气味较重，尽量在通风口操作。

实验报告要求及考核评价要求：本能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论；需正确标注所观察组织的具**置；比较实验组与对照组结果有差异否？具体原因？

六、场地、设备与器材

实验场地：待定

实验设备与器材：冰箱、烘箱、通风橱（通风柜）、显微镜、自动搅拌器、精密天平等

《细胞生物学》课程实验项目4

胞间连丝及液泡系的观察

一、实验目的

了解植物胞间连丝的结构与类型；了解动物细胞中光学显微镜下膜泡系；掌握徒手切片观察胞间连丝的方法；掌握临时制片观察动物细胞中的膜泡结构。

二、实验内容

植物与动物胞间连丝及液泡系的观察。

三、实验原理

多细胞植物是一个统一的整体。细胞虽有细胞壁包围着，相互分隔，但细胞壁并非把两个细胞绝然分开。它们的细胞壁之间有纹孔，细胞内的细胞质形成原生质丝－胞间连丝，从这里通过它跟相邻细胞沟通，交换物质，起细胞间物质运输和信息传递的作用。

细胞中的膜泡结构可被中性红染色，故可在光学显微镜下观察其结构膜泡的存在。

四、实验方法与步骤

1、红辣椒表皮细胞（观察胞间连丝）：取一小块红辣椒，用小刀小心刮除果肉，留下一层极薄的表皮，制片镜检观察（光线不要太亮）。

2、玉米糊粉层（观察胞间连丝）：剥去玉米籽（浸泡在水中1天）表皮，露出糊粉层，徒手切片观察。

3、口腔粘膜细胞（观察液泡）：将一滴中性红（含0.9% NaCl）滴于载玻片中央。用消毒牙签刮取口腔粘膜细胞，并在中性红液中摩擦片刻，盖上盖玻片，显微镜观察（注意观察核周围的红色小液泡）。

五、实验要求

实验内容要求：（1）在刮红辣椒表皮果肉时，应尽量刮的干净，便于观察胞间连丝；（2）在切玉米糊粉层时应尽量切薄，且应切取黄色部位；（3）观察口腔粘膜细胞时，应把观察光线调暗，便于观察到小液泡。

实验报告要求及考核评价要求：本能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论；需正确标注所观察组织的具**置。

六、场地、设备与器材

实验场地：待定

实验设备与器材：显微镜、自动搅拌器等

《细胞生物学》课程实验项目5

线粒体的分离与观察

一、实验目的

掌握差速离心法分离动物细胞线粒体原理及方法；掌握詹纳斯绿染线粒体的方法。

二、实验内容

动物线粒体的分离与观察。

三、实验原理

制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心。在一定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物，由于沉降速度不同将停留在不同的位置。悬浮介质通常用蔗糖缓冲溶液，它比较接近细胞的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体。线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由此吸引堆积在线粒体膜上。线粒体上的细胞色素氧化酶使詹纳斯绿B保持氧化状态，呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。

四、实验方法与步骤

1、匀浆：取1g肝细胞，剪碎，加9ml、0.25ml/L蔗糖缓冲液匀浆，单层尼龙布过滤于10ml试管中备用。

2、差速离心：取1ml 0.34mol蔗糖缓冲液于1.5 ml离心管中，然后沿管壁小心加入肝匀浆，约0.5ml覆盖于上层，700×g (3000rpm)离心10分钟，弃沉淀取上清液，10000×g (12000rpm)离心10分钟，沉淀为线粒体。

3、染色：取线粒体沉淀涂片，加1滴0.02%詹纳斯绿B染色15min。

4、观察：盖上盖玻片，显微镜观察。

五、实验要求

实验内容要求：（1）线粒体沉淀涂片时注意浓度不要太高；（2）观察在显微镜呈蓝绿色，但因普通显微镜放大倍数不够，观察不到小棒状或亚铃状。

实验报告要求及考核评价要求：本能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论；需正确标注所观察组织的具**置。

六、场地、设备与器材

实验场地：待定

实验设备与器材：显微镜、移液枪、移液管、尼龙布、高速离心机等

《细胞生物学》课程实验项目6

扫描电子显微镜技术（演示）实验

一、实验目的

了解扫描电镜工作原理和结构，观摩扫描电镜操作演示。

二、实验内容

扫描电子显微镜操作（演示）。

三、实验原理

在Oatley等学者的努力下，于1965年研制成功了世界上第一台实用扫描电镜(scanning electron microscope， SEM)商品。其功能是用来观察标本的表面形态结构。它将标本表面上发射出的次级电子，由带样电荷的栅极收集后，即向电子显象管发送信号，在荧光屏上显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本表面的真实结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本要进行特殊处理。标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下会发出次级电子信号，可用于电子成像。

1. 扫描电镜的基本结构

扫描电镜在结构上主要是由电子枪、电磁透镜、扫描线圈、样品室、信号的收集、处理及显示系统，以及真空系统和供电保护系统等部分组成。其中，电子枪、电磁透镜、扫描线圈又被称为电子光学系统。

其电子枪所发射电子的波长一般为1~10nm，使用的电压范围为1~10KV。扫描线圈为扫描电镜所特有的结构，可作光栅状扫描，以便在荧光屏上显示出扫描图像。扫描电镜的样品室较大，样品有专用的样品托，可在样品室内进行各不同方向的平移和倾转；另外，在样品室内还装配有检测部件。信号的收集、处理及显示系统包括次级电子探测器、光电倍增管和显象管。次级电子探测器又由闪烁体和光导管构成，主要作用是收集由标本表面发射出的次级电子，并将其转变成光子；光电倍增管可将光子信号放大后，又将其转换成电压信号；而显象管便便可将所接受到的电压信号转变成为亮度不同的图像。

2. 扫描电镜的成像原理

电子枪发射出的电子束，经电磁透镜会聚成极细的电子束，并进而聚焦在待测样品表面；由于样品各不同部位的表面形貌不同，入射电子束与样品表面所喷涂的重金属原子相互作用后所产生的次级电子信号也不同; 此次级电子信号为探测器接受后，被转变成光子，传递给光电倍增管进行放大和转换；转换成的电压信号经扫描线圈扫描后显示在显象管的荧光屏上。

由于扫描线圈在样品上作扫描光栅状的逐点扫描，再加上显象管的偏转线圈电流与扫描线圈电流高度同步，因此，显象管荧光屏上的任何一点的亮度与样品表面上相应点所发出的次级电子数均是一一对应的，因此，显示在荧光屏上的图像就是样品表面形貌的真实写照。

四、实验方法与步骤

4.1. 电镜操作的演示

电镜理论学习与上机观察，参观电镜照片等分组交叉进行。

4.2. 电镜照片的展示

挑选一批具有代表性的动植物细胞不同超微结构的电镜照片，供同学们观察和学习，以了解各种亚细胞结构的超微结构特征。

五、实验要求

实验内容要求：（1）为节约时间，收取实效建议每组10人，以两组或三组，争取2～3h完成全部内容。

实验报告要求及考核评价要求：本能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论；需正确标注所观察组织的具**置。

六、场地、设备与器材

实验场地：待定

实验设备与器材：扫描电子显微镜、超薄切片机、制刀机、动物或植物细胞的超薄切片、各种细胞亚显微结构照片等。

《细胞生物学》课程实验项目7

透射电子显微镜技术（演示）实验

一、实验目的

了解透射电镜工作原理和结构，观摩透射电镜操作演示。

二、实验内容

扫描电子显微镜操作（演示）。

三、实验原理

透射电子显微镜是把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像。通常，透射电子显微镜的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～百万倍，用于观察超微结构，即小于0.2µm、光学显微镜下无法看清的结构，又称“亚显微结构”。

透射电子显微镜的成像原理可分为三种情况：

1. 吸收像：当电子射到质量、密度大的样品时，主要的成相作用是散射作用。样品上质量厚度大的地方对电子的散射角大，通过的电子较少，像的亮度较暗。早期的透射电子显微镜都是基于这种原理。

2. 衍射像：电子束被样品衍射后，样品不同位置的衍射波振幅分布对应于样品中晶体各部分不同的衍射能力，当出现晶体缺陷时，缺陷部分的衍射能力与完整区域不同，从而使衍射钵的振幅分布不均匀，反映出晶体缺陷的分布。

3. 相位像：当样品薄至100Å以下时，电子可以传过样品，波的振幅变化可以忽略，成像来自于相位的变化。

透射电子显微镜的组件:

1. 电子枪：发射电子，由阴极、栅极、阳极组成。阴极管发射的电子通过栅极上的小孔形成射线束，经阳极电压加速后射向聚光镜，起到对电子束加速、加压的作用。

2. 聚光镜：将电子束聚集，可用已控制照明强度和孔径角。

3. 样品室：放置待观察的样品，并装有倾转台，用以改变试样的角度，还有装配加热--冷却等设备。

4. 物镜：为放大率很高的短距透镜，作用是放大电子像。物镜是决定透射电子显微镜分辨能力和成像质量的关键。

5. 中间镜：为可变倍的弱透镜，作用是对电子像进行二次放大。通过调节中间镜的电流--可选择物体的像或电子衍射图来进行放大。

6. 透射镜：为高倍的强透镜，用来放大中间像后在荧光屏上成像。

7. 此外还有二级真空泵来对样品室抽真空、照相装置用以记录影像。

透射电子显微镜在材料科学、生物学上应用较多。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，样品的密度、厚度等都会影响到最后的成像质量，必须制备更薄的超薄切片，通常为50～100nm。所以用透射电子显微镜观察时的样品需要处理得很薄。常用的方法有：超薄切片法、冷冻超薄切片法、冷冻蚀刻法、冷冻断裂法等。对于液体样品，通常是挂预处理过的铜网上进行观察。

四、实验方法与步骤

4.1. 电镜操作的演示

电镜理论学习与上机观察，参观电镜照片等分组交叉进行。

4.2. 电镜照片的展示

挑选一批具有代表性的动植物细胞不同超微结构的电镜照片，供同学们观察和学习，以了解各种亚细胞结构的超微结构特征。

五、实验要求

实验内容要求：（1）为节约时间，收取实效建议每组10人，以两组或三组，争取2～3h完成全部内容。

实验报告要求及考核评价要求：本能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论；需正确标注所观察组织的具**置。

六、场地、设备与器材

实验场地：待定

实验设备与器材：透射电子显微镜、动物或植物细胞的超薄切片、各种细胞亚显微结构照片等。

《细胞生物学》课程实验项目8

荧光显微镜及荧光染料的使用

一、实验目的

学习荧光显微镜及荧光染料的使用。

二、实验内容

学习荧光显微镜及荧光染料的使用。

三、实验原理

（1）荧光显微镜：某些物质经一定波长的光（如紫外光）照射后，物质中的分子被激活，吸收能量后跃迁至激发态；当其从激发态返回到基态时，所吸收的能量除部分转化为热量或用于光化学反应外，其余较大部分则以光能形式辐射出来，由于能量没能全以光的形式辐射出来，故所辐射出的光的波长比激发光的要长，这种波长长于激发光的可见光部就是荧光(fluorescence)。所谓荧光就是某些物质在一定波长光（如紫外光）的照射下、在极短时间内所发出的比照射光波长更长的可见光。由此可见，被照射物质产生荧光必须具备以下两个条件：①物质分子（或所特异性结合的荧光染料）必须具有可吸收能量的生色团；②该物质还必须具有一定的量子产率和适宜的环境（如溶剂、pH、温度等）。

荧光显微术是利用荧光显微镜结合可发荧光的物质进行观测的一种实验技术。某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如见光)，这种光就称为荧光。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接产生荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不能产生荧光，但它吸收荧光染料后同样却能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后便可发出桔红色荧光。

荧光显微镜具特殊光源（多为紫外光光源），提供足够强度和波长的激发光，诱发荧光物质发出荧光。在视场中所所观察到的图像，主要是样品的荧光映像。

（2）荧光染料的使用

吖啶橙：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光；EB：染色DNA和RNA；荧光素双醋酸酯(FDA)：FAD 本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后，由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光，无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。5mgFDA溶于1ml丙酮中，避光4℃下贮存，使用时取0.22mlFDA贮存液加入5ml0.65mol/L甘露醇中.使用时，使最终浓度为0.01%。

荧光染料Ho33342和若丹明123: 活细胞双荧光染色观察细胞核和线粒体。一般的生物染料不能穿透细胞膜，只有当细胞被固定后改变了细胞膜的通透性，染料才能进入细胞内。但有些活体染料能进入活细胞，并对细胞不产生毒性作用。荧光染料Ho33342和若丹明123都是活体染料。Ho33342能与细胞中DNA进行特异的结合，若丹明123能与线粒体进行特异的结合。采用两种荧光染料的混合染液可对一个活细胞的核和线粒体同时染色。荧光组化实验中应注意的几个问题：（1）每种荧光染料，均有自己的最适pH值，此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的PH值的缓冲液中进行；（2）一放荧光染色在20℃以下时荧光比较稳定，温度升高常出现温度猝灭；（3）在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进行观察，需照相时再适当增强激发光；（4）一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。

四、实验方法与步骤（荧光显微镜的使用）

1、荧光显微镜汞灯的点亮：打开启动器电源开关，按下起动钮不超过5秒钟，点亮汞灯，5min后便进行观察。点亮后15min内，不可切断电源；此外，一旦汞灯熄灭后，在20min或稍长时间内，不许重新点亮，须待汞灯冷却后，方能再次点亮。

2、青菜手切片的制备：用剔须刀片将新鲜的嫩菠菜叶切削出一斜面置于载玻片上，滴加1滴水，加盖片后轻压，置荧光显微镜下观察。

3、样品聚焦：将菠菜手切片放在载物台上，先用溴钨灯透射照明，用低倍镜聚焦，待找到最佳影像后，熄灭溴钨灯，改用高压汞灯。

4、调整荧光显微镜：在观察样品时，视场光阑(F)和孔径光阑(A)的开度适当缩小，同时选择滤镜系统和二向色镜，直至使叶绿体的自发荧光达到最佳的观察效果。

5、荧光染色观察：向所制手切片上滴加1~2滴0.01%吖啶橙染液，染色1min，洗去余液，加盖片后，在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光。

五、实验要求

实验内容要求：（1）在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈；（2）用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光，气孔仍为绿色。

实验报告要求及考核评价要求：本能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论。

六、场地、设备与器材

实验场地：待定

实验设备与器材：荧光显微镜等

《细胞生物学》课程实验项目9

细胞融合（演示）

一、实验目的

掌握细胞融合的方法。

二、实验内容

细胞电融合演示实验。

三、实验原理

在现代生物学研究中，细胞电融合是单克隆抗体制备、哺乳动物克隆以及抗肿瘤疫苗制备等最新方法中的一个基本步骤。与通过聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合的化学方法相比，细胞电融合是一种更高效的方法。

细胞电融合原理：（1）通过双向电泳使细胞间的接触变得非常紧密。普通电泳采用直流电来移动分子，双向电泳则与之不同，采用了高频交流电。在活细胞等微粒的内部，诱导去极化，引起细胞聚集，排列成串珠状，互相紧密接触。（2）然后给予短暂的高压脉冲，引起细胞膜的穿透，此时质膜的脂类分子发生重组，同时由于细胞表面的张力作用，使两个细胞融合逐步完成。为了稳定这个过程，在短期内需要施加交流电压。（3）刚完成电融合的融合细胞可称为异核体，因为尽管表面的细胞膜已经发生了融合，细胞内仍可以看到两个或两个以上的细胞核。随后，细胞核也会在细胞内部发生融合。在多数情况下，该过程会导致核中的染色体数量急剧下降。

四、实验方法与步骤（荧光显微镜的使用）

1、取1ml鸡血，加4ml生理盐水，1200rpm的清洗1次。

2、加0.6mol/L甘露醇（或蔗糖）1200rpm清洗3次。

3、加0.6mol/L甘露醇调成2×105个/ml鸡血红细胞悬液。

4、把鸡血红细胞悬液放置在融合小室中。

5、加成串电压20-25v，cell排列成串。

6、加脉冲电压280v，使cell融合（按脉冲触发钮一下）。

五、实验要求

实验内容要求：无。

实验报告要求及考核评价要求：本能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论。

六、场地、设备与器材

实验场地：待定

实验设备与器材：荧光显微镜、电激仪、精密天平、自动搅拌器、细胞分散器、细胞分离器、细胞计数器、高速离心机、高速冷冻离心机、低速离心机、移液枪、微量进样器、恒温水浴锅、控温摇床、烘箱、冰箱、超净工作台、二氧化碳培养箱、光照培养箱等

《细胞生物学》课程实验项目10

巨噬细胞吞噬现象的观察

一、实验目的

观察巨噬细胞吞噬现象。

二、实验内容

巨噬细胞吞噬现象的观察。

三、实验原理

巨噬细胞由骨髓干细胞分化生成，然后进入血液到达各组织内，并进一步分化为各种巨噬细胞，当病原微生物或其它异物侵入机体时，能招引巨噬细胞，而巨噬细胞又有趋化性，能响应招引因子的招引，产生活跃的变形运动，主动向病原体和异物移行，在接触到病原体和异物时，即伸出伪足，将之包围并内吞入胞质，形成吞噬体，继而细胞质中的初级溶酶体与吞噬泡发生融合，形成吞噬性溶酶体，通过其中水解酶等作用下，将病原体杀死，消化分解，最后将不能消化的残渣排了出细胞外。

台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。

四、实验方法与步骤（荧光显微镜的使用）

1、在小鼠腹腔注射6%淀粉肉汤（含台盼蓝）1ml。

2、24h后注射1%鸡红细胞悬液1ml，轻按腹部使分散。

3、20分钟后脱颈骨处死小鼠。

4、开腹取腹腔液。

5、腹腔液滴于载玻片上，盖上盖玻片。

6、显微镜观察吞噬现象。

五、实验要求

实验内容要求：开腹取腹腔液时慎防小鼠血污染。

实验报告要求及考核评价要求：本能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论。

六、场地、设备与器材

实验场地：待定

实验设备与器材：显微镜等

《细胞生物学》课程实验项目11

细胞DNA含量的定量测量

一、实验目的

观察巨噬细胞吞噬现象。

二、实验内容

巨噬细胞吞噬现象的观察。

三、实验原理

DNA经盐酸水解，使嘌呤碱基和脱氧核糖之间键打开，使核糖的一端形成自由醛基，SCHIFF试剂与醛基反应形成紫色化合物，使细胞内的DNA显示出来，固绿着色浅染，用于衬托DNA的颜色。

四、实验方法与步骤（荧光显微镜的使用）

1、取小鼠附睾一只，放入5ml小烧杯中，加1-2滴生理盐水，然后剪碎捣碎，再加0.5 ml生理盐水，制成悬浊液。

2、用单层尼龙布过滤到青霉素小瓶中。

3、制作小鼠**涂片。

4、取小鼠肝脏一小片，用双面刀片切新鲜切面，在载波片上制印片(如印章一样轻轻印一下，而不是涂片；否则没有完整的肝细胞)。

5、吹风机吹干。

6、乙醇固定10 min(放入染色缸中)。

7、自来水漂洗一下。（非冲洗，以免冲走粘着的细胞）。

8、60℃下盐酸水解15 min(放入染色缸中)。

9、SCHIFF试剂浸染4-6 h(放入染色缸中)。

10、自来水漂洗一下。（非冲洗，以免冲走粘着的细胞）。

11、固绿快染4 s。

12、自来水漂洗一下。（非冲洗，以免冲走粘着的细胞）

13、吹风机吹干。

14、显微镜观察。

15、显微数码拍照，比较**和肝细胞内的DNA含量。

五、实验要求

实验内容要求：（1）详见具体实验步聚；（2）正确取小鼠附睾。

实验报告要求及考核评价要求：本能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论。

六、场地、设备与器材

实验场地：待定

实验设备与器材：显微镜、恒温水浴锅、吹风机、显微数码相机、精密天平、自动搅拌器等

《细胞生物学》课程实验项目12

原生质体的分离及培养

一、实验目的

学习和掌握植物叶片原生质体的分离及培养。

二、实验内容

植物叶片原生质体的分离及培养。

三、实验原理

植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“**细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中，酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜，必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性，使原生质体分离后不致膨胀破裂，渗透剂常用甘露醇或蔗糖，酶液还应含一定Ca2+来稳定原生质膜。其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。将原生质体接种在培养基上进行培养，细胞壁再生，细胞分裂和再生植株。

测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法，FAD 本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后，由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光，无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。

细胞计数一般用血细胞计数极，按白细胞计数法进行计数。

从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以，为了制备健康的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期的愈伤组织或器官为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的外壁，则不能被酶降解。因此，取材成为实验成功与否的首要问题。

四、实验方法与步骤（荧光显微镜的使用）

1、把叶片(或花期短的花瓣)洗净，把表面水吸干。（2人一组）

2、撕去叶片背面的表皮，用2ml离心管的盖打下1圆片。圆片扣压于 0.5ml酶液面上。让去除下表皮的一面接触酶液，辅满一层。0.5ml酶液已放入2ml离心管中。（酶液：4%纤维素酶， 2%果胶覆酶，PH5.8，0.6mol/L甘露醇）。0.11g/L甘露醇

3、28~30℃保温酶解2~6h（放培养箱中）；镜检叶肉细胞原生质体、用血球计数板计数。

4、600 rpm 离心5min，使原生质体沉降。吸除上面的酶液。

5、加MS培养液液1ml洗涤，轻轻混匀，600 rpm 离心5min，使原生质体沉降。吸除上面的溶液。

6、加MS培养液液0.5ml，轻轻混匀，用血球计数板计数细胞密度，FDA染色测定原生质体的活性。

7、扣上盖子，在26℃下进行暗培养。观察细胞壁的再生和细胞分裂。

五、实验要求

实验内容要求：（1）正确使用细胞计数器。

实验报告要求及考核评价要求：本能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论。

六、场地、设备与器材

实验场地：待定

实验设备与器材：显微镜、细胞计数器、摇床、移液枪、精密天平、自动搅拌器、离心机、二氧化碳培养箱、光照培养箱等

《细胞生物学》课程实验项目13

叶绿体的分离与荧光观察

一、实验目的

了解细胞匀浆和差速离心分级分离细胞组分的原理。了解提取叶绿体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的叶绿体的一般形态，增加对叶绿体的感性认识；掌握吖啶橙染色叶绿体的方法；掌握显微数码拍照的方法。

二、实验内容

提取叶绿体，吖啶橙染色，观察染色结果；显微数码拍照。

三、实验原理

将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。在一定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部。叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35 mol/L Nacl或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，离心后可得沉淀的叶绿体。

四、实验方法与步骤（荧光显微镜的使用）

1、取嫩叶3 g，洗净去柄去叶脉，剪碎放入研钵中。

2、加10 ml 0.35mol/L Nacl，加少量石英砂，研磨匀浆，尼龙布过滤于离心管中约4ml。

3、1000 rpm离心2分钟弃去沉淀。

4、3000 rpm离心15分钟，弃去上清液，将沉淀用少量0.35m Nacl悬浮。

5、提取叶绿体观察：①普通光镜；②荧光光镜；③加吖啶橙。

6、撕取叶表皮观察：①普通光镜；②荧光光镜；③加吖啶橙。

7、显微数码拍照。

五、实验要求

实验内容要求：（1）在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色椒榄形，在高倍镜下看到叶绿体内部含有较深的绿色的绿色小颗粒即基粒；（2）在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光；（3）加入吖啶橙染后，叶绿体可发也桔红色荧光。而其中混有的细胞核发出绿色荧光菠菜叶手切片观察；（4）在普通光镜下可以看到三种细胞：表皮细胞为边缘吐锯齿表的鳞片状细胞；保卫细胞为构成气孔的成对存在的肾形细胞；叶肉细胞为排成栅状的长形和椭圆形细胞。

实验报告要求及考核评价要求：本能正确、详尽书写实验目的、实验基本原理、操作步骤，正确客观的记录实验结果，并对实验结果（尤其是不理想的实验结果）进行分析和讨论。

六、场地、设备与器材

实验场地：待定

实验设备与器材：荧光显微镜、数码相机、摇床、移液枪、离心机等