教学大纲

《生化实验技术与方法》课程实验教学大纲

一、课程概况(CourseOverview

课程名称:生化实验技术与方法

Course  Biochemistry Technology

课程编号:0081800015                  适用学生:     生物科学

Course Number0081800015              Designed for: Science of Biology

学分:   36          学时:   1       独立设课:是

Credit   36         Class hour: 1       Independent courseyes

预修课程:

Preparatory courses:                     

二、课程简介Course  Descriptions

生化实验技术与方法是在基础生物化学实验的基础上开设的以综合性实验和设计性实验为主的一门课程。

The experimental methods of biochemistry are explored from the perspective of essential physical principles and with hands-on experiences in the laboratory.

三、实验项目一览表(Experiment project schedule)

序号

No.

实验名称

Name

每组人数

Members of each group

实验

时数

Hours

实验类型

验证∕综合∕设计

Course Type

Verifying/Synthetic/Designing

必做∕选做

Required Course

/Elective Course

1

糖的薄层层析

2

5

验证

实验

必做

2

红细胞膜的制备

2

4

验证

实验

必做

3

SDSPAGE测定红细胞膜蛋白分子量

2

9

验证

实验

必做

4

乳酸脱氢酶同工酶的制备

2

5

验证

实验

必做

5

乳酸脱氢酶活力测定

2

4

验证

实验

必做

6

RNA提取

2

9

综合

必做

四、推荐教材及参考书目 (Recommended Teaching Materials and Reference Books)

采用张龙翔等主编的《生化实验方法和技术(第二版)》教材。

五、考核与评价方式(Course Evaluation)

实验报告必须包括:①实验原理;②仪器;③方法和结果;④结果讨论。重点在第4部分。

实验考核方式应根据:①实验操作情况;②实验报告内容。

评分方法:实验操作和实验报告各占50

六、场地、设备与器材(Site, equipment and consumable materials)

电泳仪、电泳槽,柱层析系统,紫外分光光度计,高速冷冻离心机,恒温水浴,摇床,烘箱,冰箱,显微镜,光照培养箱,超净工作台,凝胶成象系统,低温贮存箱,分析天平,低温高速离心机,酸度计,电动搅拌器,真空泵,真空干燥箱,恒流泵,核酸蛋白检测仪,紫外分析仪,记录仪,自动部分收集器,电脑,投影仪,打印机,相机,蒸馏水仪,漩涡混合器,磁力搅拌器,制冰机,超声波清洗机,吹风机,试剂瓶,滴管,试管,铁架台,铁夹,十字夹,铁圈,试管架,试管夹,纱布,漏斗,移液枪,移液枪架,移液管,移液管架,玻棒,镊子,剪刀,培养皿,比色皿,点样器,微量进样器,烧杯,秒表,电炉,钢筋锅,锥形瓶,量筒,离子交换树脂,层析管,碱式滴定管,酸式滴定管,制胶架,注射器,塑料桶,曲线纸,干燥剂,温度计,离心管,枪头,枪头盒,皮管,pH试纸,层析玻板,载玻片,漏斗。

撰写人:审定人:


《生化技术》课程实验项目1

糖的薄层层析

一、实验目的

学习和掌握薄层层析的原理和方法掌握高速冷冻离心机的使用方法,学习红细胞膜制备的原理和方法

二、实验内容

糖的薄层层析红细胞膜的制备。

三、实验原理

薄层层析是一种微量而快速的层析方法。该法是把吸附剂或支持剂涂布在玻璃板上成为一薄层,将要分析的样品滴加到薄层上,然后用合适的溶剂进行展开,使样品各个成分分离,然后进行定性鉴定和定量测定。根据原理的不同薄层层析通常有4种类型:吸附薄层层析,分配薄层层析,离子交换薄层层析和薄层电泳。本次实验是以硅胶H为吸附剂的薄层层析。硅胶H是粘性差的纯硅胶;其特性是能用腐蚀性显色剂检测。

膜对细胞的结构和功能起重要的作用,近年来,生物膜的结构与功能的研究已成为生命科学研究领域的一个热点。而在相关研究中,膜的分离和鉴定是许多相关研究的基础。

本次实验是根据红细胞在不同的离子状态中的存在形式不同,采用分步离心的方法得到红细胞膜。

四、实验方法与步骤

()、糖的薄层层析

1. 硅胶H薄板的制备:注意胶要均匀。

2. 板的处理:

薄板的活化:活化后冷却的速度不能过快。

薄板的刮分:径向层析的优点是:样品展层后图谱呈弧形带状,使Rf值相近的化合物也能清楚地分开。

3. 点样:样品为鼠李糖、甘露糖、木糖和葡萄糖。点样量20-30μl。注意:点样点的直径小于2mm,点样要少量多次,吹风机风力不能过大。

4. 展层:展层溶剂为:乙酸乙酯:甲醇:乙酸:水=12332(体积比),新鲜配制。

5. 显色:显色剂:苯胺-二苯胺-磷酸试剂。

(二)、红细胞膜的制备:

1. 猪血收集于含抗凝剂(肝素钠)的容器中。

2. 2ml血液在43000 r/min,离心20min。用吸管吸尽血浆及沉淀表面的绒毛状物质。

3. 沉淀的红细胞中加5ml pH 7.4的等渗磷酸盐缓冲液,45000 r/min,离心15min。除上清液及沉淀表层。根据沉淀情况,重复该操作2-3次。

4. 洗净的红细胞加20ml低渗Tris-HCI缓冲液,边加边搅拌,4,放置1-2小时。49000 r/min,离心15min。根据沉淀情况,重复该操作2-3次。

5. 收集红细胞膜于支管中。-20冰箱备用。

五、实验要求

1、学生在实验操作过程中全部自己动手完成,2人为1组。

2、完成实验报告:对实验结果进行分析、讨论。

六、场地、设备与器材

烘箱,冰箱,分析天平,酸度计,蒸馏水仪,漩涡混合器,磁力搅拌器,超声波清洗机,吹风机,试剂瓶,滴管,试管,载玻片,漏斗,微量进样器,烧杯,秒表,量筒,塑料桶,干燥剂,层析玻板,标准糖。
《生化技术》课程实验项目2

红细胞膜的制备

一、实验目的

学习红细胞膜制备的原理和方法

二、实验内容

红细胞膜的制备。

三、实验原理

膜对细胞的结构和功能起重要的作用,近年来,生物膜的结构与功能的研究已成为生命科学研究领域的一个热点。而在相关研究中,膜的分离和鉴定是许多相关研究的基础。

本次实验是根据红细胞在不同的离子状态中的存在形式不同,采用分步离心的方法得到红细胞膜。

四、实验方法与步骤

1. 猪血收集于含抗凝剂(肝素钠)的容器中。

2. 2ml血液在43000 r/min,离心20min。用吸管吸尽血浆及沉淀表面的绒毛状物质。

3. 沉淀的红细胞中加5ml pH 7.4的等渗磷酸盐缓冲液,45000 r/min,离心15min。除上清液及沉淀表层。根据沉淀情况,重复该操作2-3次。

4. 洗净的红细胞加20ml低渗Tris-HCI缓冲液,边加边搅拌,4,放置1-2小时。49000 r/min,离心15min。根据沉淀情况,重复该操作2-3次。

5. 收集红细胞膜于支管中。-20冰箱备用。

五、实验要求

1、学生在实验操作过程中全部自己动手完成,2人为1组。

2、完成实验报告:对实验结果进行分析、讨论。

六、场地、设备与器材

低温高速离心机,烘箱,冰箱,显微镜,低温贮存箱,分析天平,酸度计,电动搅拌器,相机,蒸馏水仪,漩涡混合器,制冰机,超声波清洗机,试剂瓶,滴管,试管,试管架,试管夹,纱布,漏斗,移液枪,移液枪架,移液管,移液管架,玻棒,漏斗镊子,剪刀,培养皿,烧杯,秒表,量筒,塑料桶,pH试纸,血液,。



《生化技术》课程实验项目3

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量

一、实验目的

掌握SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理和方法。

二、实验内容

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量。

三、实验原理

SDS:十二烷基硫酸钠,是一种阴离子去污剂。其作用原理主要是:

(1) 在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后,巯基乙醇使蛋白质分子中的二硫键还原;SDS使蛋白质的氢键、疏水键打开,并结合到蛋白质分子上,形成蛋白质-SDS复合物。在一定条件下,SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS / 1g蛋白质。由于十二烷基硫酸根带负电,使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷,他的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

(2)  SDS与蛋白质结合后,引起蛋白质构象的改变。不同蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状都近似于长椭圆棒状,它们的短轴长度相同,而长轴与蛋白质分子量成正比。

在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS后,使蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量Mr而与所带电荷和形状无关。

lgMr = K1-bm

K1为常数,b为斜率。

利用一系列已知蛋白质分子量的蛋白质进行SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后测定它们的相对迁移率,就可以作出标准曲线。因此,未知蛋白质只要进行SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳,测定出它们的相对迁移率就可以在标准曲线上查出lgMr,从而求出分子量。

四、实验方法与步骤

1. 胶的制备

编号

溶液名称

10%分离胶

3%浓缩胶

1

30% Acr –0.8% Bis

6.66

-

2

pH 8.9 Tris -HCI

2.5

-

3

10% Acr –0.5% Bis

-

3.0

4

pH 6.7 Tris- HCI

-

1.25

5

10%SDS

0.2

0.1

6

1%TEMED

2.0

1.0

7

H2O

8.54

4.6

8

10%AP

0.1

0.05

总体积(mL


20

10

2. 加样:

标准蛋白质

分子量

兔磷酸化酶B

97 400

牛血清白蛋白

66 200

兔肌动蛋白

43 000

牛碳酸酐酶

31 000

胰蛋白酶抑制剂

20 100

鸡蛋清溶菌酶

14 400

待测样品:(1)血红蛋白,2)花生的水溶性蛋白

样品的处理:按0.5mg蛋白质/1mL溶液的比例向标准蛋白质或待测样品中加入样品溶解液(小试管),充分溶解后,加盖(不要密闭),置沸水浴30min,取出冷至室温。

加样量:20μl.

3. 电泳:点样端负极,恒压:开始180V,待样品进入分离胶后300V

电极缓冲液:pH 8.3 Tris –Gly

4. 染色:脱色考马斯亮兰R-2501h

5. 脱色:先用蒸馏水冲洗凝胶,再用脱色液(冰醋酸:蒸馏水:甲醇=7587550)脱色1h

五、实验要求

1、学生在实验操作过程中全部自己动手完成,2人为1组。

2、完成实验报告:对实验结果进行分析、讨论。

六、场地、设备与器材

电泳仪、电泳槽,紫外分光光度计,高速冷冻离心机,恒温水浴,摇床,烘箱,冰箱,凝胶成象系统,低温贮存箱,分析天平,酸度计,电动搅拌器,真空泵,真空干燥箱,电脑,投影仪,打印机,相机,蒸馏水仪,漩涡混合器,磁力搅拌器,制冰机,超声波清洗机,吹风机,试剂瓶,滴管,试管,铁架台,铁夹,十字夹,铁圈,试管架,试管夹,纱布,漏斗,移液枪,移液枪架,移液管,移液管架,玻棒,镊子,剪刀,培养皿,比色皿,微量进样器,烧杯,秒表,电炉,钢筋锅,锥形瓶,量筒,制胶架,注射器,塑料桶,曲线纸,干燥剂,温度计,离心管,枪头,枪头盒,皮管,pH试纸。


《生化技术》课程实验项目4

乳酸脱氢酶同工酶的分离

一、实验目的

通过乳酸脱氢酶同工酶的分离(琼脂糖凝胶电泳法),进一步理解什么是同工酶,学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法以及用于检出同工酶的活性染色法。

二、实验内容

乳酸脱氢酶同工酶的分离

三、实验原理

采用强阴离子交换柱吸附乳酸脱氢酶同工酶(LDH),再用不同盐浓度的缓冲液洗脱,可以简便、快速的将5种同工酶分开,再用聚丙烯酰胺凝胶电泳予以鉴定。

四、实验方法与步骤

(一)样品处理:1克组织切碎,加20mM Tris-HCIpH 7.4缓冲液10mL,匀浆,10,000g 4℃,离心10 min,上清液可直接用于上柱。

(二)装柱:将层析柱固定,保持垂直位。将浸胀的QAE-Sephadex A-50装入柱内,至6-7cm高度。装柱时应注意均匀,凝胶内不得有气泡,凝胶床要平整,流速< 1mL/min

(三)样品分离

1. 上样:提取液0.3 mL加在凝胶面上,待样品进入凝胶后再加入少量缓冲液,使样品完全进入胶内。

2. 洗脱:采用不连续梯度洗脱。先用5mL的缓冲液(20mM Tris-HCIpH 6.3缓冲液)洗脱。流速< 1mL/min,洗脱液经核酸蛋白检测仪监视,分管收集,每管1mL,此第一部分为LDH-5,继之用10mL的缓冲液B(含60mM NaCI20mM Tris-HCIpH 6.3缓冲液)洗脱,分管收集,第二部分为LDH-4,再以缓冲液CDE依次分别洗脱,收集,即可将5种同工酶分开。

五、实验要求

1、学生在实验操作过程中全部自己动手完成,2人为1组。

2、完成实验报告:对实验结果进行分析、讨论。

六、场地、设备与器材

电泳仪、电泳槽,柱层析系统,紫外分光光度计,高速冷冻离心机,恒温水浴,摇床,烘箱,冰箱,显微镜,光照培养箱,超净工作台,凝胶成象系统,低温贮存箱,分析天平,低温高速离心机,酸度计,电动搅拌器,真空泵,真空干燥箱,恒流泵,核酸蛋白检测仪,紫外分析仪,记录仪,自动部分收集器,电脑,投影仪,打印机,相机,蒸馏水仪,漩涡混合器,磁力搅拌器,制冰机,超声波清洗机,吹风机,试剂瓶,滴管,试管,铁架台,铁夹,十字夹,铁圈,试管架,试管夹,纱布,漏斗,移液枪,移液枪架,移液管,移液管架,玻棒,镊子,剪刀,培养皿,比色皿,点样器,微量进样器,烧杯,秒表,电炉,钢筋锅,锥形瓶,量筒,离子交换树脂,层析管,制胶架,注射器,塑料桶,曲线纸,干燥剂,温度计,离心管,枪头,枪头盒,皮管,pH试纸,漏斗。


《生化技术》课程实验项目5

乳酸脱氢酶同工酶的活力测定

一、实验目的

通过乳酸脱氢酶同工酶的分离(琼脂糖凝胶电泳法),进一步理解什么是同工酶,学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法以及用于检出同工酶的活性染色法。

二、实验内容

采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶同工酶的活力实验原理。

三、实验方法与步骤

1.丙酮酸及NADH溶液25度水浴预热;

2.取两只石英比色皿,一只作为空白对照,加入3ml 0.1M pH7.5 磷酸盐缓冲液,调节A340 0,另一只用于测定LDH活力。

3.加入2.9ml 丙酮酸溶液,0.1ml NADH溶液,摇匀并测定记录A340

4.取出比色皿,加入适当稀释的酶液(1-10微升),摇匀并立即记录,每隔0.5min A340,连续测定3min

5.A340对时间作图,取反应线性部分,计算△A340减少值。

四、实验要求

1、学生在实验操作过程中全部自己动手完成,2人为1组。

2、完成实验报告:对实验结果进行分析、讨论。

五、场地、设备与器材

紫外分光光度计,高速冷冻离心机,恒温水浴,烘箱,冰箱,酸度计,蒸馏水仪,漩涡混合器,制冰机,超声波清洗机,试剂瓶,滴管,试管,移液枪,移液枪架,移液管,移液管架,玻棒,比色皿,微量进样器,烧杯,秒表,曲线纸,干燥剂,温度计,离心管,枪头,枪头盒, pH试纸。


《生化技术》课程实验项目6

经典总RNA的抽提

一、实验目的

通过实验使同学们掌握生物体大分子RNA分离制备的基本方法和注意事项,和常用仪器的使用。

二、实验内容

小鼠肝脏总RNA的提取

三、实验原理

TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使**白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。

四、实验方法与步骤

()、从动物组织中抽提总RNA

1.为降低RNA降解的可能性,组织从动物体取出后迅速放入液氮。

2.从液氮中取出样品,迅速称重(50g)。

3.500μl变性缓冲液(Denaturing Solution),和3.6μlβ-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)置于匀浆器中混匀。将组织置于匀浆器中进行研磨。将组织运浆转移到1.5ml离心管中。

4.在上述离心管中加入50μl2mol/L 醋酸钠溶液(Sodium Acetate),混匀。

5.加入500μl的水饱和酚(Phenol saturated with water),混匀。水饱和酚上有 一层水相保护层,取水饱和酚时应将Tip伸到下面的有机层。

6.加入100μl氯仿/异戊醇(Chloroform/Isoamyl alcohol),拧紧盖子,剧烈混匀。

7.12000rpm室温离心5min。应形成清晰两相。如没有分层,可以补加少许Chloroform/Isoamyl alcohol,拧紧盖子,剧烈混匀,重新离心。RNA在上层水相中。

8.小心将上层水相转移到无菌的RNase-free的离心管中,不要吸取中间任何物质,否则会出现基因组DNA污染。

9.加入500μl异丙醇(Isopropanl),上下颠倒混匀。

10.12000rpm室温离心5min。小心弃去上清,沉淀用500μl 75%乙醇洗2次。75%乙醇用DEPC-H2O配制。室温放置10min,尽可能彻底去除离心管内的乙醇。

11.20μl DEPC-H2O溶解沉淀。如沉淀难以溶解,可在68℃处理10 min

()RNA的电泳鉴定

1.1%琼脂糖电泳胶的制备:0.5g琼脂糖加30mL DEPC-H2O,在为微波炉中熔化后,加5mL 10×RBS溶液,冷却至50℃,加8.9mL甲醛溶液,再加6.1 mL DEPC-H2O,混匀后倒入电泳槽上。

2.上样:6μl样品加2μl样品缓冲液,于65℃加热5min,然后加2溴酚兰指示剂混匀,点样。80V电泳1.5h

3.胶用溴化乙锭染色1h,在水中脱色过夜,紫外灯下观察并记录实验结果。

五、实验要求

1、学生在实验操作过程中全部自己动手完成,2人为1组。

2、完成实验报告:对实验结果进行分析、讨论。

六、场地、设备与器材

电泳仪、电泳槽,紫外分光光度计,高速冷冻离心机,恒温水浴,摇床,烘箱,冰箱,生化培养箱,超净工作台,凝胶成像系统,低温贮存箱,分析天平,低温高速离心机,酸度计,电动搅拌器,真空泵,真空干燥箱,恒流泵,核酸蛋白检测仪,紫外分析仪,记录仪,自动部分收集器,电脑,投影仪,打印机,相机,蒸馏水仪,漩涡混合器,磁力搅拌器,制冰机,超声波清洗机,试剂瓶,滴管,试管,铁架台,试管架,试管夹,纱布,漏斗,移液枪,移液枪架,移液管,移液管架,玻棒,镊子,剪刀,培养皿,比色皿,点样器,微量进样器,烧杯,秒表,电炉,钢筋锅,锥形瓶,量筒,干燥剂,温度计,离心管,枪头,枪头盒,皮管,pH试纸,层析玻板,载玻片,漏斗,小鼠,液氮。