《环境工程微生物学》课程实验教学大纲

一、课程概况（CourseOverview）

课程名称：环境工程微生物实验

Course：Environmental Engineering Microbiology

课程编号：1071400010适用学生:环境科学专业

Course Number：1071400010 Designed for:Environmental Science

学分：2               学时：48           独立设课：是

Credit：2  Class hour:48Independent course：yes

预修课程：分析化学、有机化学、生物化学、环境工程微生物学

Preparatory courses:Analytical chemistry, organic chemistry, biochemistry，Environmental Engineering Microbiology

二、课程简介（Course  Descriptions）

环境工程微生物实验是环境科学专业一门重要的实验课，它是环境污染治理与微生物学相结合而产生发展起来的一门边缘性学科，是理论教学的重要组成部分，通过实验训练，主要进行微生物形态的观察、微生物的染色、分离、培养和接种等基本技术以及环境中微生物（细菌）的测定方法等使学生掌握环境工程微生物学最基本的操作技能；培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力。为后续专业课的学习和从事本专业尤其是环境工程微生物学方向的研究奠定基础。

Environmental Engineering Microbiology is an important experimental course in Environmental Science,It is the environmental pollution control and microbiology developed arising from the combination of an interdisciplinary subject, is an important part of teaching the theory, experimental training, mainly for observation of microbial morphology, staining of microorganisms isolated, cultured, and vaccinations basic technology and the environment of microorganisms (bacteria) method to the determination of environmental engineering students to master basic microbiology skills; train students to observe, think, analyze and solve problems. For the following specialized courses of study and engaged in this profession, especially the direction of environmental engineering microbiology basis for the study.

三、实验项目一览表(Experiment project schedule)

四、推荐教材及参考书目 (Recommended Teaching Materials and Reference Books)

1.推荐教材

环境工程微生物学实验(高等学校规划教材)代群威 主编，化学工业出版社 ：2010.1

Recommended Teaching Materials:

2.参考书目

苑宝玲主编 环境工程微生物学实验，化学工业出版社 2006.1

Reference Books

五、考核与评价方式(Course Evaluation)

实验考核包括：①平时实验情况及实验报告内容；②选择性实验成绩。

实验考核方式应根据：①平时实验情况及实验报告内容；②选择性实验方案与可行性报告及实验小论文；

评分方法：平时成绩和实验报告占70％，选择性实验方案与可行性报告及实验小论文占总成绩的30%。

。

撰写人：阮琴审定人： 

《环境工程微生物学》课程实验项目1

光学显微镜的使用

一、实验目的

1.熟悉光学显微镜基本结构和用途；

2.掌握显微镜维护的基本知识；

3.掌握低倍镜、高倍镜、油镜的使用方法。

二、实验内容

1.介绍显微镜的构造

2.显微镜的正确使用方法

3.显微镜使用的注意事项

三、实验原理

光学显微镜是利用反射光将不透明物体放大后进行观察。光学显微镜是由两个透镜组成，称为目镜和物镜，当所观察的物体置于物镜，物体的反射光线穿过物镜经折射后，就得到一个放大了大的倒立实像。所以，观察到的像是经物镜和目镜两次放大的结果。油镜，以香柏油或石蜡油为介质。这类油的折射率和玻璃的折射率大致相同。光线从被检物体直接射入物镜，其间因折射或反射而引起的光线损失很小，所以可以充分利用镜口角，显著提高物镜的分辨率。

三、实验方法与步骤

（一）光学显微镜的构造

（1）机械系统部分

（2）光学系统部分

（3）照明系统部分

（4）图像记录系统

（二）光学显微镜的使用

1.低倍镜的使用

（1）取镜

（2）放镜

（3）对光

（4）放片

（5）调焦(粗调焦和细调焦)

2.高倍镜的使用

（1）定位

（2）换镜

（3）调焦(细调焦)

3.油镜的使用

(1)先用低倍镜观察标本的概况。

(2)更换高倍镜，把所要观察的部分移到视野中央。

(3)把镜筒上升约1.5厘米，再把油镜转到工作位置。

(4)在盖玻片上所要观察的位置滴一小滴香柏油(或石蜡油)。

(5)调焦，观察

(6)观察完毕后，提升镜筒清洁，复位。

四、实验要求

实验内容要求：完成所有实验内容。

实验报告必须包括：①实验目的及原理；②仪器；③方法步骤和结果；④结果讨论。

考核评价：对实验操作情况及实验报告综合评定

实验操作成绩：包括学习态度、实验操作是否正确规范、实验结果是否正确、打扫卫生等方面。

实验报告成绩：包括实验报告的格式是否正确、原理是否论述清楚、实验结果分析讨论是否符合逻辑，报告字迹是否清楚等方面。

五、场地、设备与器材

场地：12幢304。

设备与器材：显微镜，玻片标本、擦镜纸、载玻片、擦布、香柏油、二甲苯等。

《环境工程微生物学》课程实验项目2

培养基的制备及灭菌

一、实验目的

1、明确培养基的配制原理。
2、通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
3、学习并掌握高压灭菌锅的使用。

二、实验内容

1、基础培养基的配制

2、高压灭菌锅的使用

三、实验原理

培养基是指人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。
用于培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。由碳源、能源、氮源、无机盐、生长因子、水等6部分组成。

四、实验方法与步骤

(1)称量：按培养基配方比例依次准确地称取所需药品放入搪瓷杯中。牛肉膏等膏状药品常用玻棒挑取，放在载玻片上称量，其它放在称量纸称量。蛋白胨很易潮解，称取时动作要迅速。

(2)溶化：在上述搪瓷杯中加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，在电炉上加热使其溶解，将药品完全溶解后并煮沸后，加入琼脂粉，再加热溶化（勿溢出），补充热水到所需的总体积。

(3)调pH：用1mol/LNaOH或1mol/LHCl进行调节，直至pH达到所需要求。

(4)分装：将配制好的培养基分装入试管内或三角烧瓶内（每人5支试管）。

(5)加塞、包扎：

培养基分装完毕后，在试管口塞上棉塞（橡胶塞），每十支试管为一捆，外加牛皮纸，用棉纱线扎好；三角烧瓶口用4-6层纱布加牛皮纸包扎。

(6)灭菌：将上述培养基置于高压灭菌锅内灭菌：0.1MPa，121 ℃ ，20min高压蒸汽灭菌。

(7)搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷至50 ℃左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在玻璃或其他合适高度的器皿上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

(8)无菌检查：灭菌培养基放入37℃的室温中培养24~48h，以检查灭菌是否彻底。

五、实验要求

实验内容要求：掌握配制培养基的一般方法和步骤，学会高压灭菌锅的使用。

实验报告要求：明确目的、原理、操作步骤，如实记录结果，并对实验过程的得失进行反思，分析哪些方面自己做的比较好，有可能是哪些原因造成实验结果的不理想或者失败；

考核评价要求：实验过程中的态度，结果的正确性，实验报告的规范性，是否对实验结果进行讨论及讨论的正确性。

六、场地、设备与器材

场地：12幢304

设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、电热板、酸度计、培养箱、烘箱等。

器材：铁架台、电炉、刻度搪瓷杯、量筒、三角烧瓶、试管、玻棒、牛皮纸、纱布、粗棉线、漏斗、试管塞、pH试纸、载玻片、小烧杯、称量纸、牛角匙、漏斗、试管架、铁丝筐、剪刀、乳胶管、石棉网等。

药品：牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉、氯化钠、葡萄糖、酵母膏、可溶性淀粉、硝酸钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硝酸钠、氯化钾、蔗糖、氢氧化钠、盐酸等。

《环境工程微生物学》课程实验项目3

环境中微生物的检测

一、目的：

1、学习不同来源微生物的采样、分离方法。

2、比较不同来源微生物的数量和类型。

3、学习制平板方法和微生物的接种技术。

4、体会无菌操作的重要性。

二、实验内容

实验台、人体、空气等不同来源样品中细菌的数量、种类，学习制平板方法和微生物的接种技术。

三、实验原理

培养基中含有细菌生长所需的营养成分，当不同来源的样品接种在营养平板上，在适宜的条件下培养一段时间，可形成一个个肉眼可见的子细胞集团——菌落，每种细菌所形成的菌落都有各自的特点，因此可通过菌落数量、形态的观察测定不同样品中细菌的数量和类型。

四、实验方法与步骤

（一）制平板

将牛肉膏蛋白胨培养基加热溶化，待冷至55~60℃时倒平板，每人倒10皿。水平放置，凝固成两个平板。

将上述平板底面分别用记号笔写上样品来源、稀释度，同时写上组别或学号。

（二）采样与接种

1、实验台

（1）取一平板，皿底划上直线分为3部分。

（2）采样（具体操作见示范）

取一支棉签，沾上无菌水，在实验台上擦拭越约2cm2的范围。

（3）接种：将棉签在平板顶端某一点滚一下。

（4）划线：取接种环在酒精火焰上灭菌，冷却后通过接种区向下划线，直至平板一半处；盖上皿盖，转动平板，分2次划线接种剩余的2个1/4。

2、人体细菌的检查（手指）

（1）在皿底划一直线,写上记号。

（2）在平板两边分别用未洗和洗过的手指划线接种。

3、空气中细菌的检测（沉降法）

打开皿盖，使平板表面暴露在空气中5min。

4、对照：不做任何处理。

（三）培养：

将上述各处理的牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃，温室中培养24h。

（四）结果观察与记录

1、计数

2、菌落特征观察

五、实验要求

实验内容要求：掌握样品稀释、倒平板的方法，练习无菌操作技能，培养无菌操作意识。

实验报告要求：明确目的、原理、操作步骤，如实记录结果，并对实验过程的得失进行反思和分析。

考核评价要求：实验过程中的态度，结果的正确性，实验报告的规范性，是否对实验结果进行讨论及讨论的正确性。

六、场地、设备与器材

场地：12幢304

设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、电热板、培养箱、冰箱、烘箱、磁力搅拌机、超净工作台等。

器材：铁架台、电炉、搪瓷杯、量筒、三角烧瓶、试管、玻棒、牛皮纸、纱布、粗棉线、漏斗、试管塞、pH试纸、涂棒、培养皿、5mL移液管、0.5mL移液管、0.1mL移液管、移液枪、不同规格的枪头、酒精灯、火柴、移液管筒、培养皿筒等

药品：牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉、氯化钠、无菌水等。

《环境工程微生物学》课程实验项目4

微生物的分离与纯化

一、实验目的

1、掌握倒平板的方法。

2、学习从土壤中分离细菌的方法。

3、练习无菌操作技能。

二、实验内容

采用稀释涂布平板法分离土壤中的细菌，无菌操作技术。

三、实验原理

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。土壤是微生物的大本营，含有极其丰富的微生物，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

本实验采用稀释涂布平板法分离土壤中的细菌：将待分离材料作一系列稀释（1/10，1/100，1/1000，…），将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在营养平板表面，用无菌涂棒将菌液涂匀，适宜温度下培养一定时间后，挑取单个菌落，重复以上过程，从而获得纯培养。

四、实验方法与步骤

1、制备土壤稀释液：

（1）采样：取表层以下5-10cm处的土样，放入灭菌袋，带回实验室备用。

（2）制备稀释液

称取土样1g，放入盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将细胞分散。

用一支0.5ml无菌吸管吸取0.5ml土壤悬液加入盛有4.5ml无菌水的试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取0.5ml加入另一盛有4.5ml无菌水的试管中，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 、10-7不同稀释度的土壤溶液。

2、倒平板

培养基加热熔化，待冷至55~60℃时倒平板，每组倒六皿。水平放置，凝固成平板。将上述六个平板底面分别用记号笔写上稀释度、组别或学号

3、吸取菌液

用无菌吸管分别吸取相应土壤稀释液各0.1ml，对号放入已写好稀释度的平板中，

4、涂布

用无菌玻璃涂棒（或不锈钢涂棒）在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基。

5、培养将牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养箱中培养1~2d。

6、挑菌落

（1）选择一个菌落（取菌落较大的），记录菌落特征。

（2）然后将其挑取少许细胞接种到试管斜面上，37℃培养。待菌苔长出后，检查其特征是否一致以初步确定是否是单一的微生物。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

7、观察各个平板上的菌落分离和菌落数，选取合适稀释度下2个平板上的菌落数（单位：CFU）。

五、实验要求

实验内容要求：掌握样品稀释、倒平板的方法，练习无菌操作技能，培养无菌操作意识。

实验报告要求：明确目的、原理、操作步骤，如实记录结果，并对实验过程的得失进行反思，分析哪些方面自己做的比较好，有可能是哪些原因造成实验结果的不理想或者失败。

考核评价要求：实验过程中的态度，结果的正确性，实验报告的规范性，是否对实验结果进行讨论及讨论的正确性。

六、场地、设备与器材

场地：12幢304

设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、电热板、培养箱、冰箱、烘箱、磁力搅拌机、超净工作台等。

器材：铁架台、电炉、搪瓷杯、量筒、三角烧瓶、试管、玻棒、牛皮纸、纱布、粗棉线、漏斗、试管塞、pH试纸、涂棒、培养皿、5mL移液管、0.5mL移液管、0.1mL移液管、移液枪、不同规格的枪头、酒精灯、火柴、移液管筒、培养皿筒等

药品：牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉、氯化钠。

土样。

《环境工程微生物学》课程实验项目5

细菌的革兰氏染色

一、实验目的

1.学习并掌握细菌的革兰氏染色法。

2.了解革兰氏染色原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

二、实验内容

学习细菌的革兰氏染色法。

三、实验原理

革兰氏染色法可把细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，是由这两类细菌的细胞壁的结构和组成不同决定的。结晶紫作为初染剂进行染色，碘作为媒染剂，乙醇(或丙酮)作脱色剂，最后用复染剂（如番红）复染。G+菌的肽聚糖含量高，层次多，交链度高，壁上间隙小，媒染后的结晶紫——碘的复合物不易脱出细胞壁，加上它基本上不含脂类，乙醇脱色后，不但没出现缝隙，反而因肽聚糖网孔脱水而变得通透性更小，结果结晶紫——碘复合物就留在细胞内而呈蓝色。G-菌的肽聚糖含量低，层次少，类脂含量高，乙醇脱色后，类脂质被溶解细胞壁通透性变大，使结晶紫——碘复合物较易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞染上复染剂的红色。

四、实验方法与步骤

(1) 制片：涂片，干燥，固定。

(2) 初染：滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜），染色1~2min后水洗。

(3)媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。

(4) 脱色：将玻片倾斜，在白色的背景下 ，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。

(5)复染：用番红液复染约2min，水洗。

(6)干燥

(7)镜检：１０Ｘ下找到观察视野后用油镜（100X)观察细菌形态、染色结果。

(8)结果记录并画图

五、实验要求

实验内容要求：掌握制片和染色方法，加强无菌操作技能。

实验报告要求：须包括：①实验目的及原理；②仪器；③方法步骤和结果；④结果讨论。

考核评价要求：实验过程中的态度，实验操作及实验报告是否正确规范是否对实验结果进行讨论及讨论的正确性。

六、场地、设备与器材

场地：12幢304。

设备：显微镜、培养箱、冰箱、烘箱、超净工作台等

器材：三角烧瓶、试管、玻棒、牛皮纸、纱布、粗棉线、漏斗、试管塞、pH试纸、涂棒、培养皿、载玻片、酒精灯、火柴、接种环、吸水纸、擦镜纸等

药品：牛肉膏蛋白胨培养基、结晶紫、番红、95%酒精、无水酒精、碘、碘化钾、香柏油、草酸铵、蒸馏水等

菌种：大肠杆菌(E, .coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草杆菌（Bacillus subtilis）等。

《环境工程微生物学》课程实验项目6

细菌的芽孢、鞭毛、荚膜染色法

一、实验目的

1、学习并掌握鞭毛、芽孢、荚膜的染色方法。
2、鉴定未知菌是否具有这三种结构。

二、实验内容

1、用硝酸银染色法染色未知细菌，确定未知细菌是否具有鞭毛。

2、用Schaefer-Fulton氏法染色未知细菌，确定未知细菌是否具有芽孢。

3、用负染色法染色未知细菌，确定未知细菌是否具有荚膜。

三、实验原理

1、鞭毛染色法

鞭毛是细菌的纤细丝状运动“器官”，鞭毛的有无、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标，鞭毛的直径一般为10-30nm，要在光学显微镜下观察，须用媒染剂处理，使鞭毛直径加粗，再进行染色观察。

2、芽孢染色法

细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。用着色力强的染色剂在加热条件下使芽孢染色，用水洗使菌体脱色，再用复染剂复染，使菌体和芽孢分别呈现不同的颜色，能更明显地衬托出芽孢，便于观察。

3、荚膜染色法

荚膜是包裹在某些细菌细胞外的一层黏液状或胶状物质，含水量高，其他成分主要为多糖、多肽或糖蛋白等。荚膜不易着色且容易被水洗去，因此常用负染法进行染色，使背景着色，荚膜不着色，在深色背景下呈现发亮区域。

四、实验方法和步骤

1、鞭毛染色法：

（1）菌种和玻片的准备

（2）制片：涂片→自然干燥→固定

（3）染色：A液覆盖约 3～5min →蒸馏水洗去A液→B液去残水→B液覆盖约数秒～1min（涂面明显褐色）→蒸馏水洗→自然干燥

（4）镜检：油镜观察（100X)

2、芽孢染色法

(1)制片：涂片→干燥→固定

(2)染色：加数滴孔雀绿于涂片上→用木夹子夹住玻片的一端→加热冒气→维持5min（注：勿干涸）。

(3)水洗：待玻片冷却后→用水冲洗至流出水无色。

(4)复染：用番红液复染2min，水洗。

(5)镜检：油镜观察（100X)。

3、荚膜染色法

(1)制备菌和墨汁混合液：加1滴碳素墨水于洁净载玻片上，然后挑取少量菌体与其混合，再加适量蒸馏水，充分混合；

(2)加盖玻片（注：勿有气泡）；

(3)镜检：高倍镜观察（背景黑色，菌体黑色，菌体周围的清晰透明圈为荚膜）。

五、实验要求

1、确定未知细菌是否具有鞭毛、芽孢、荚膜这三种特殊结构。

2、记录实验结果, 画图。

六、场地、设备与器材

实验场地：12幢304

设备：显微镜、培养箱、冰箱、烘箱、超净工作台等

器材：试管、牛皮纸、纱布、粗棉线、试管塞、pH试纸、载玻片、盖玻片、酒精灯、火柴、吸水纸、接种环、试管架、镊子、擦镜纸、木夹子等

培养基及药品：牛肉膏蛋白胨培养基、硝酸银、单宁酸、氨水、甲醛、三氯化铁、黑墨水、孔雀绿、番红、无水酒精、香柏油、甲醛、氢氧化钠等

菌种：假单孢菌（Pseudomonas）、变形杆菌（Bacillus proteusvulgaris）、固氮菌(Azotobacteriaceae)、枯草杆菌（Bacillus subtilis）等。

《环境工程微生物学》课程实验项目7

放线菌、霉菌的形态观察

一、实验目的

1、学习放线菌的插片接种法，了解放线菌的形态特征。
2、学习从环境中分离培养霉菌的方法，了解常见霉菌的基本形态特征。

二、实验内容

观察并比较5406放线菌、青霉、曲霉、根霉等霉菌的个体形态和菌落形态特征。

三、实验原理

放线菌的菌落特征：干燥、不透明，表面呈紧密的丝绒状，上有一层色彩鲜艳的干粉；菌落与培养基的连接紧密，难以挑取。放线菌的菌丝有基内菌丝、气生菌丝、孢子丝之分，为了便于观察，常用插片法、玻璃纸法、印片法来培养放线菌。本次实验应用插片法进行培养，使不同菌丝生长在盖玻片的不同位置，从而方便、清楚地观察各类菌丝。

霉菌即发霉的真菌，菌丝体发达而又不产生大型子实体的真菌，往往在潮湿的气候下大量生长繁殖，长出肉眼可见的丝状、绒状或蛛网状的菌丝体。霉菌的菌丝也有基内菌丝、气生菌丝、繁殖菌丝之分，但菌丝粗大，各类菌丝往往有特化形式，可在显微镜下直接观察到，因此本实验采用直接制片观察法，将培养物置于乳酸石碳酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片直接镜检观察。

四、实验方法与步骤

（一）放线菌的观察

1、倒平板：取融化并冷至50 ℃的高氏1号培养基约20mL倒平板，凝固待用。

 2、插片：以无菌操作用镊子将灭菌盖玻片以大约45度角插入培养基内。

 3、接种：用接种环挑取菌种，划线接种在培养基表面与盖玻片的交接处。

4、培养：将插片平板倒置，28 ℃培养3~5d。

5、镜检：首先观察记录菌落特征，包括颜色、形态等；然后用镊子小心拔出盖玻片，擦去背面培养物，将有菌的一面朝上放在载玻片上，直接镜检，观察基内菌丝、气生菌丝、孢子丝及孢子。

（二）霉菌的观察

1、在载玻片上加一滴蒸馏水（或乳酸石炭酸棉蓝染色液），用镊子从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，放到蒸馏水滴或染液中，用接种针小心地将菌丝挑开（如孢子较多，可先置于50%酒精或蒸馏水中洗去）。

2、盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。注意观察菌丝有无分隔，繁殖菌丝及孢子的形态，有无一些特殊结构等。

五、实验要求

实验内容要求：学习插片法和直接制片观察法，了解放线菌、常见霉菌的基本形态特征。

实验报告要求：实验报告必须包括：①实验目的及原理；②仪器；③方法步骤和结果；④结果讨论。

考核评价：对实验操作情况及实验报告综合评定

实验操作成绩：包括学习态度、实验操作是否正确规范、实验结果是否正确、打扫卫生等方面。

六、场地、设备与器材

场地：12幢304。

设备：显微镜、培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅等

器材：电炉、三角瓶、试管、牛皮纸、纱布、粗棉线、试管塞、pH试纸、盖玻片、酒精灯、火柴、吸水纸、接种针(环)、记号笔、擦镜纸、镊子、解剖针等

培养基及药品：高氏一号培养基、查氏合成培养基、PDA培养基、75%酒精、乳酸石炭酸棉蓝染色液、无水酒精、50%乙醇等

菌种：细黄链霉菌(Strep. microflavus)、青霉（Penicillum）、曲霉（Aspergillus）、根霉(Rhizopus)、毛霉(Mucor)等。

《环境工程微生物学》课程实验项目8

酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别

一、实验目的

1、观察酵母菌的形态及出芽生殖。
 2、学习区分酵母菌 死活细胞的实验方法。

二、实验内容

观察酵母菌的形态及出芽生殖，区分酵母菌 死活细胞，并计算酵母菌的死亡率。

三、实验原理

酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有性繁殖通过接合产生子囊孢子。

美蓝是一种无毒性的染料。它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此酵母活细胞是无色的，而死细胞或衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，以此进行鉴别。

四、实验方法与步骤

美蓝浸片的观察：

（1）在载玻片中央加一滴0.05%吕氏碱性美蓝染色液，用滴管取1滴酵母菌菌液于染液中，混合均匀。

（2）加盖玻片。注：不要产生气泡。

（3）将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据颜**别死、活细胞。

（4）染色约0.5h后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。

（5）绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征，并计算0.5h后酵母菌的死亡率。

五、实验要求

实验内容要求：绘图说明所观察到的酵母菌的形态特征，并计算 0.5h后酵母菌的死亡率。

实验报告要求：明确目的、原理、操作步骤，如实记录结果并绘图并对结果进行分析。

考核评价要求：实验过程中的态度，结果的正确性，实验报告的规范性，是否对实验结果进行讨论及讨论的正确性。

六、场地、设备与器材

场地：12幢304。

设备：显微镜、培养箱、高压蒸汽灭菌锅、摇床等。

器材：电炉、三角瓶、试管、牛皮纸、纱布、粗棉线、试管塞、pH试纸、盖玻片、酒精灯、火柴、吸水纸、接种环、记号笔、擦镜纸、镊子、目镜测微尺、镜台测微尺、血球计数板、载玻片、盖玻片、无菌毛细吸管等。

培养基及药品：PDA培养基、酵母合成培养基、95%酒精、美蓝、无水酒精、氢氧化钾等。

菌种：啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。

《环境工程微生物学》课程实验项目9

微生物的大小测定和直接计数

一、实验目的

1、学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。
 2 、掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。

二、实验内容

1 、学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。
 2 、掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。

三、实验原理

1、微生物大小的测定

微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定需借助测微尺——目镜测微尺和镜台测微尺。球菌用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范围来表示。

2、微生物的直接计数

显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。

四、实验方法与步骤

1、微生物大小的测定：

（1）装目镜测微尺(换目镜)

（2）校正目镜测微尺：

1）放镜台测微尺

2）校正

3）计算

（3）菌体大小测定：

2、微生物的直接计数

（1） 菌悬液制备

（2）镜检计数室

（3）加样品

（4）显微镜计数

（5）清洗血细胞计数板

五、实验要求

实验内容要求：测定啤酒酵母的大小；计数待测菌悬液的浓度。

实验报告要求：明确目的、原理、操作步骤，如实记录结果，并对实验过程及结果进行分析。

考核评价要求：实验过程中的态度，结果的正确性，实验报告的规范性，是否对实验结果进行讨论及讨论的正确性。

六、场地、设备与器材

场地：12幢304。

设备：显微镜、培养箱、高压蒸汽灭菌锅、摇床等

器材：电炉、三角瓶、试管、牛皮纸、纱布、粗棉线、试管塞、pH试纸、盖玻片、酒精灯、火柴、吸水纸、接种环、记号笔、擦镜纸、镊子、目镜测微尺、镜台测微尺、血球计数板、载玻片、盖玻片、无菌毛细吸管等

培养基及药品： PDA培养基、酵母合成培养基、95%酒精、美蓝、无水酒精、氢氧化钾等

菌种：啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。

《环境工程微生物学》课程实验项目10

细菌的生理生化

一、实验目的

1、了解微生物对大分子物质水解的原理和方法，了解糖发酵及IMViC的原理和方法。

2、鉴定未知菌对淀粉、明胶的水解能力。

3、鉴定未知菌糖发酵试验、IMViC 试验中的能力。

二、实验内容

1、大分子物质的水解实验：淀粉水解实验、明胶水解实验。

2、葡萄糖发酵试验

3、IMViC试验

三、实验原理

1、大分子物质的水解实验

微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须通过产生的胞外酶将大分子物质分解后才能吸收和利用。胞外酶主要为水解酶，如淀粉酶可水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油、脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实，如：

淀粉水解：用碘液测定，如无蓝色产生，说明细菌产生淀粉酶；脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH值，使加入培养勘探指示剂变色；明胶是由胶原蛋白经水解产生的蛋白质，在25℃以下维持凝胶状态，呈固体形式存在，在25℃以上明胶会液化。有些微生物能产生明胶酶，水解明胶而使之液化，甚至在4℃仍能保持液化状态。

2、葡萄糖发酵试验

糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解葡萄糖产酸并产气，伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气。发酵培养基含有指示剂（溴甲酚紫），倒置的德汉氏小管和不同的糖类，当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH 6.8）变为黄色（pH 5.2），气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。

3、IMViC试验

（1） 吲哚试验是用来检测吲哚的产生。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。

（2）甲基红试验是用来检测葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色（pH 6.3）变为红色（pH 4.2），即甲基红反应。

（3） 伏-普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏-普反应阳性。（4）柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸盐是否被利用。有些细菌能利用柠檬酸盐作为碳源，在分解柠檬酸盐和培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，使pH升高，使培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色转化为深蓝色。

四、实验方法和步骤

1. 淀粉水解实验

（1）将固体淀粉培养基熔化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。

（2）平板反面分成两等份，并写上菌名，分别接种未知菌和枯草杆菌。

（3）将平板倒置在37℃温箱中培养24h。

（4）观察细菌的生长情况，将平板打开盖子，滴入少量3%碘液（或卢哥氏碘液）于平皿中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。

（5）观察有无透明圈及透明圈的大小。

2. 明胶水解实验

（1）取明胶培养基试管，用记号笔标明欲接种的菌名。

（2）用接种针穿刺接种。

（3）将接种后的试管置22℃中，培养2~5d。

（4）观察明胶液化情况。

3、糖发酵试验

(1)用记号笔在试管外壁上注上标记。

(2)接种。

(3)置37℃培养24～48h。

(4) 观察试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。

4、MIVIC试验

（1） 接种与培养

蛋白胨水培养基（吲哚试验），葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红试验和伏-普试验），柠檬酸盐培养基，置37℃培养2d。

（2）结果观察

1）吲哚试验：于培养2d后的蛋白胨水培养基内加8滴乙醚，振荡数次，静置1～3min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入5滴吲哚试剂，放入保温箱中保温15min，观察：

在乙醚和培养物之间有红色环状物 →吲哚试验阳性

2）甲基红试验：培养2d后，将培养物一分为二，1支培养物内加入甲基红试剂2滴，观察颜色的变化：

培养基变为红色→阳性，黄色→阴性。

3）伏-普试验 ：另1支葡萄糖蛋白胨水培养物内加入5～10滴40%KOH，然后加入等量的5%α-萘酚，用力振荡，再放入37℃温箱中保温15～30min，以加快反应速度。观察颜色变化：培养物呈红色者→伏-普反应阳性。

4）柠檬酸盐试验培养48h 后观察柠檬酸盐斜面培养基上有无细菌生长和是否变色。

蓝色→阳性， 绿色→阴性

五、实验要求

实验内容要求：完成所有实验内容。

实验报告必须包括：①实验目的及原理；②仪器；③方法步骤和结果；④结果讨论。

考核评价：对实验操作情况及实验报告综合评定

实验操作成绩：包括学习态度、实验操作是否正确规范、实验结果是否正确、打扫卫生等方面。

实验报告成绩：包括实验报告的格式是否正确、原理是否论述清楚、实验结果分析讨论是否符合逻辑，报告字迹是否清楚等方面。

六、场地、设备与器材

实验场地：12幢304

设备：显微镜、培养箱、高压蒸汽灭菌锅、摇床等

器材：电炉、钢筋锅、三角瓶、试管、牛皮纸、纱布、粗棉线、试管塞、pH试纸、载玻片、酒精灯、火柴、吸水纸、接种针、接种环、记号笔、试管架、培养皿、培养皿筒等

培养基及药品：固体淀粉培养基、明胶培养基、葡萄糖发酵培养基、蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐培养基、碘液、溴甲酚紫、甲基红、吲哚试剂、溴麝香草酚蓝、V-P试剂、乙醚等

菌种：大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、普通变形杆菌（Bacillus proteusvulgaris）等。

《环境工程微生物学》课程实验项目11

微生物对有机物的降解与转化

一、实验目的

1、了解微生物对大分子物质水解的原理和方法。
2、鉴定实验菌种对大分子物质的水解能力。

二、实验内容

微生物对淀粉、蛋白质、油脂、牛乳等大分子物质的水解。

三、实验原理

微生物不能直接利用大分子的淀粉、蛋白质和脂肪，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白为氨基酸等。

这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实：淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。明胶是由胶原蛋白经水解产生的蛋白质，在25°C以下维持凝胶状态，呈固体形式存在，在25°C以上明胶会液化。有些微生物能产生明胶酶，水解明胶而使之液化。脂肪水解后产生脂肪酸使pH降低，使加入培养基中中性红指示剂由浅红变深红。有些微生物能水解牛奶中的蛋白质酪素，使浑浊的石蕊牛奶培养基变澄清。石蕊牛奶也常被用来检测乳糖发酵，酸存在时，石蕊变粉红色；氨基酸的分解使pH变碱，使石蕊变紫色；某些细菌能还原石蕊使试管底部变白色。

四、实验方法与步骤

1. 淀粉水解实验

（1）将固体淀粉培养基溶化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。

（2）平板反面分成两等份，并写上菌名，分别接种未知菌和枯草杆菌。

（3）将平板倒置在37℃温箱中培养24h。

（4）观察细菌的生长情况，将平板打开盖子，滴入少量3%碘液（或卢哥氏碘液）于平皿中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。

（5）观察有无透明圈及透明圈的大小。

2. 明胶水解实验

（1）取明胶培养基试管，用记号笔标明欲接种的菌名。

（2）用接种针穿刺接种。

（3）将接种后的试管置22℃中，培养2~5d。

（4）观察明胶液化情况。

3、油脂水解试验

（1）将溶化的培养基冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。

（2）用记号笔在平板底部划成二部分，分别写上菌名。

（3）划线接种。

（4）将平板倒置在37℃温箱中培养24h。

（5）取出平版，观察菌苔颜色。

若出现红色斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。

4、石蕊牛奶试验

（1）取2支石蕊牛奶培养基试管，分别标上菌名。

（2）分别接种。

（3）将接种后试管置于35 ℃培养箱中，培养24~48h。

（4）观察培养基颜色变化。

石蕊在酸性条件下为粉红色，碱性条件下为紫色，被还原时为白色。

五、实验要求

实验内容要求：熟练掌握相关实验技术。无菌意识强。

实验报告要求：明确目的、原理、操作步骤，如实记录结果，并对实验结果进行讨论，从实验现象分析说明自己的未知菌具备相应的利用能力。

考核评价要求：实验过程中的态度，结果的正确性，实验报告的规范性，是否对实验结果进行讨论及讨论的正确性。

六、场地、设备与器材

场地：12幢304。

设备与器材：酒精灯，无菌试管、无菌培养皿，接种环（针），试管架，培养箱等。

《环境工程微生物学》课程实验项目12

环境因素对微生物生长的影响

一、实验目的

1、了解常用化学消毒剂对微生物的作用。

2、了解渗透压、pH对微生物生长的要求。

二、实验内容

环境因素对微生物生长的影响。

三、实验原理

1、化学因素对微生物生长的影响

常用化学消毒剂主要有重金属类、有机溶剂、卤族元素及其化合物、染料和表面活性剂等。不同化学消毒剂对微生物的影响不同。有机溶剂可使蛋白质及核酸变性，也可破坏细胞膜透性使内含物外溢；碘可使蛋白质失活；染料可选择性抑制或杀死微生物。

本实验采用滤纸片法测定化学消毒剂的杀（抑）菌作用。

2、pH值对微生物生长的影响

不同微生物对pH条件的要求各不相同，它们只能在一定的pH范围内生长，这个pH范围有宽、有窄，而其生长最适pH常限于一个较窄的pH范围，对pH条件的不同要求在一定程度上反映出微生物对环境的适应能力。

3、、渗透压对微生物生长的影响

在等渗溶液中，微生物正常生长繁殖；在高渗溶液（例如高盐、高糖溶液）中，细胞失水收缩，而水分为微生物生理生化反应所必需，失水会抑制其生长繁殖；在低渗溶液中细胞吸水膨胀，细菌、放线菌、霉菌及酵母菌等大多数微生物具有较为坚韧的细胞壁，而且个体较小，受低渗透压的影响不大。

四、实验方法与步骤

1、化学因素对微生物生长的影响

（1）将已灭菌并冷至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌平皿中，水平放置待凝固。

（2）用无菌吸管吸取0.1mL的菌悬液加入到上述平板中，用无菌三角涂棒涂布均匀。

（3）将已涂布好的平板底皿划分成5等份，每一等份内标明一种消毒剂的名称：75%酒精、0.1%升汞、3%碘酒、5%苯酚、0.2%结晶紫。

（4）用无菌镊子将小圆滤纸片（D5mm）分别浸入装有各种消毒剂溶液的试剂瓶中浸湿，无菌操作将滤纸片贴在平板相应区域。

（5）将上述贴好滤纸片的含菌平板倒置于37℃培养箱中，24h后取出观察抑（杀）菌圈的大小。

2、pH值对微生物生长的影响

（1）无菌操作吸取5mL不同pH（3、5、7、9、11）的牛肉膏蛋白胨液体培养基于无菌试管中。

（2）接种：每支试管分别接入0.1mL待鉴定细菌的菌悬液。

（3）培养：5支试管置于37℃培养箱保温24h。

（4）观察记录：将上述试管取出，观察细菌生长状况（混浊程度）。

3、渗透压对微生物生长的影响

（1）将含不同浓度0、2.5、5.0、10%NaCl的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基熔化、倒平板。

（2）在已凝固的平板皿底用记号笔划成二部分，分别标记，两位同学各接一边。

（3）将上述平板置于37℃培养箱中， 24h后观察并记录含不同浓度NaCl的平板上细菌的生长状况。

五、实验要求

1、实验内容要求：熟练掌握无菌操作技术。结果记录：

（1）化学因素：记录抑菌圈大小，以此比较判断各试剂抑菌能力。

（2）渗透压：“-”表示不生长、“+”表示生长、“++”表示生长良好。

（3）pH：同渗透压。将培养液充分震荡后观察。

2、实验报告要求：包括目的、原理、操作步骤，如实记录结果，并对实验结果进行讨论，从实验现象分析说明自己的实验菌种具备哪些能力。

3、考核评价要求：实验过程中的态度，结果的正确性，实验报告的规范性，是否对实验结果进行讨论及讨论的正确性。

六、场地、设备与器材

场地：12幢304。

设备与器材：培养箱、高压蒸汽灭菌锅、摇床、酸度计、分光光度计；电炉、三角瓶、试管、培养皿、牛皮纸、纱布、粗棉线、试管塞、pH试纸、载玻片、酒精灯、火柴、吸水纸、滤纸、接种环、记号笔、镊子、试管架、移液管（5mL、1mL、0.1mL）、涂布棒、铜丝篮、比色皿、96孔板等

培养基及药品：牛肉膏蛋白胨培养基、不同pH值的肉汤蛋白胨培养基、合成培养基、75%酒精、0.1%升汞、3%碘酒、5%苯酚、0.1%结晶紫、AlamarBlue染料、200微升移液枪、枪头，生理盐水、青霉素等。

菌种：大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌（Bacillus subtilis）。

《环境工程微生物学》课程实验项目13

水体中细菌总数的检测

一、实验目的

（1）掌握水样的采集方法。

（2）掌握水体中细菌总数的检测方法。

二、实验内容

1.水样的采集

2.细菌的培养

3.细菌总数的测定

三、实验原理

水中细菌总数往往同水体受有机物污染的程度呈正相关.因此,它是评价水质污染程度的—个重要指标之一。本试验采用标准平皿法对水样中细菌作计数,这是测定水中好氧和兼性厌氧异养细菌密度的方法，由于细菌在水体个能以单独个体,成对,链状,成簇或成团的形式存在,此外没有单独的一种培养基或其一环境条件能满足—个水样中所有细菌的生理要求,所以由此法所得的菌落数实际上要低于被测水样中真正存在的活细菌的数目。细菌总数是指1mL水样在营养琼脂培养基中,37℃24h培养后所生长的菌落数.一般规定,1mL自来水的总菌数不得超过100个。

四、实验方法与步骤

（一）水样的采集。

1.自来水 先将自来水龙头用火焰烧约3分钟灭菌，再开放水龙头使水流5分钟后，以来菌三角瓶摘取水样，以待分析。

2.池水、河水或湖水 应取距水面10~15厘米的深层水样。

（二）细菌总数测定

1.自来水

（1）用无菌吸管吸取1毫升水样，注入灭菌培养皿中。共做二个平皿。

（2）倾注约15毫升已熔化并冷却到45度左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基

（3）另取空灭菌培养皿，做空白对照

（4）培养基凝固后，倒置于37度培养箱，培养24小时，进行菌落计数。

两个平板的平均菌落数即为1毫升水样的细胞总数。

2.池水、河水或湖水

（1）稀释水样

稀释倍数按水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30~300个之间的浓度最为合适。（2）自最后三个稀释度的试管中各取1毫升稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一浓度做两个培养皿。

（3）各倾注约15毫升已熔化并冷却到45度左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基

（4）培养基凝固后，倒置于37度培养箱，培养24小时，进行菌落计数。

（三）菌落计数方法

1.先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个培养皿有较大片状菌苔生长时，则不应采用。而应以无片状菌苔生长的培养皿作为该稀释度的平均菌落数，若片状菌苔的大小不到培养皿的二分之一，而其余的二分之一菌落分布又很均匀时，则可将此1/2的菌落数乘2以代表全培养皿的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。

2.首先选择平均菌落数在30~300个之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围内时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细胞总数。

3.若有两个稀释度的平均菌落数均在30~300个之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若比值小于2，应取两者的平均数，若大于2，则取其中较小的菌落总数。

4.若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。

5.若所有稀释度的平均菌落数均小于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。

6.若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300个之间，则以最近300个或30个的平均菌落数乘以稀释倍数。

（四）数据处理与评价

五、实验要求

实验内容要求：完成所有实验内容。

实验报告必须包括：①实验目的及原理；②仪器；③方法步骤和结果；④结果讨论。

考核评价：对实验操作情况及实验报告综合评定

实验操作成绩：包括学习态度、实验操作是否正确规范、实验结果是否正确、打扫卫生等方面。

实验报告成绩：包括实验报告的格式是否正确、原理是否论述清楚、实验结果分析讨论是否符合逻辑，报告字迹是否清楚等方面。

六、场地、设备与器材

场地：12幢304。

设备与器材：培养箱、高压蒸汽灭菌锅、摇床、酸度计、；电炉、三角瓶、试管、培养皿、牛皮纸、纱布、粗棉线、试管塞、pH试纸、载玻片、酒精灯、火柴、吸水纸、滤纸、接种环、记号笔、镊子、试管架、移液管（5mL、1mL、0.1mL）、涂布棒、铜丝篮、比色皿、96孔板等

培养基及药品：牛肉膏蛋白胨培养基、不同pH值的肉汤蛋白胨培养基、合成培养基、75%酒精、200微升移液枪、枪头，生理盐水、灭菌水等。

《环境工程微生物学》课程实验项目14

活性污泥中生物相的观察

一、实验目的

掌握活性污泥的采集和制片，了解活性污泥或生物膜中微生物及微型动物的数量及生长状况。

二、实验内容

观察活性污泥中微生物的种类及数量

三、实验原理

活性污泥和生物膜是生物法处理废水的主体，污泥中微生物的生长、繁殖、代谢活动以及微生物之间的演替情况往往直接反映了处理状况。因此，我们在操作管理中除了利用物理、化学的手段来测定活性污泥的性质，还可借助于显微镜观察微生物的状况来判断废水处理的运行状况，以便及早发现异常状况，及时采取适当的对策，保证稳定运行，提高处理效果。为了监测微型动物演替变化状况还需要定时进行计数。

四、实验方法与步骤

 (一)压片标本的制备
1 取活性污泥法曝气池混合液一小滴,放在洁净的载玻片中央(如混合液中污泥较少,可待其沉淀后.取沉淀的活性污泥一小滴放在载玻片上;如混合液中污泥较多.则应稀释后进行观察).
2.盖上盖玻片,即制成活性污泥压片标本.在加盖玻片时,要先使盖玻片的一边接触水滴,然后轻轻放下,否则会形成气泡,影响观察.
3.在制作生物膜标本时.可用镊子从填料上刮取一小块生物膜.用蒸馏水稀释,制成菌液.以下步骤与活性污泥标本的制备方法相同.
(二)显微镜观察
1.低倍镜观察,要注意观察污泥絮粒的大小,污泥结构的松紧程度,菌胶团和丝状菌的比例及其生长状况,并加以记录和作必要的描述.观察微型动物的种类,活动状况,对主要种类进行计数。

2.高倍镜观察
用高倍镜观察，可进一步看清微型动物的结构特征。

(三)微型动物的计数
1.取活性污泥法曝气池混合液盛于烧杯内,用玻棒轻轻搅匀,如混合液较浓,可稀释成1:1的液体后观察.
2.取洗净的滴管1支(滴管每滴水的体积应预先测定,—般可选一滴水的体积为1/20mL的滴管),吸取搅匀的混合液,加一滴到计数板的中央方格内(见图4-13)，然后加上一块洁净的大号盖玻片,使其四周正好搁在计数板四周凸起的边框上。

3.用低倍镜进行计数。

4.计算

五、实验要求

实验内容要求：完成所有实验内容。

实验报告必须包括：①实验目的及原理；②仪器；③方法步骤和结果；④结果讨论。

考核评价：对实验操作情况及实验报告综合评定

实验操作成绩：包括学习态度、实验操作是否正确规范、实验结果是否正确、打扫卫生等方面。

实验报告成绩：包括实验报告的格式是否正确、原理是否论述清楚、实验结果分析讨论是否符合逻辑，报告字迹是否清楚等方面。

五、场地、设备与器材

场地：12幢304.

设备与器材：显微镜,载玻片,盖玻片,微型动物计数板、活性污泥(或生物膜)样品。

《环境工程微生物学》课程实验项目15

酚降解菌的分离及其性能的测定

一、实验目的

1、了解菌胶团形成能力的鉴定方法.
2、分离高效酚降解菌.

二、实验内容

采取酚分解能力较强的菌种，进行单菌株分离，然后进行酚分解能力的测定及菌胶团形成能力试验。

三、实验原理

在工业废水的生物处理中,对污染成分单一的有毒废水常可选育特定的高效菌种进行处理。这些高效菌具有处理效率高,耐受毒性强等优点。本试验通过筛选酚分解微生物来掌握特定高效菌种的常规分离方法。筛选所得高效酚分解菌种除了具有较强的分解酚能力外.还必须能形成菌胶团,才能在活性污泥成生物膜中保存下来。

四、实验方法与步骤

(一)采样
为了获得酚分解能力较强的菌种,可在高浓度含酚废水流经的场所采样,如排放含酚废水下水道的污泥,沉渣等,在这些地方分得的微生物往往降解酚能力较强。为了获得既能降解酚,又有良好的形成菌胶团能力的微生物,也可在处理含酚废水的构筑物中取活性污泥或生物膜进行分离.
(二)单菌株分离
1.将上述采得样品,分别置于装有玻璃珠及石英砂的250mL无菌锥形瓶中,在摇床上振荡片刻.使样品分散,细化.
2.分别以稀释平板法和划线分离法在营养肉汤琼脂平板上对样品进行分离。

3.倒置平皿，在28℃下培养48h和72h,分别挑取单菌落，接入营养肉汤琼脂斜面上,28℃培养48h.
4.将斜面培养物再次在营养肉汤琼脂平板上作划线分离,培养后长出单菌落证明无杂菌后,接入斜面,培养后置于冰箱中待测。
(三)酚分解能力的测定
1.将菌株在营养肉汤液体培养基中振荡培养至对数生长期(28℃约16～28h)。

2.在培养物中加入少量浓酚液,使培养液内酚浓度达到10mg L^-1左右,进行酚分解酶的诱发。
3.继续振荡培养2h后再次加入浓酚液,使培养液酚浓度提高到50mg L^-1左右,继续振荡培养4h。用四氨基安替比林比色法,测定培养液中残留酚的浓度,并算出酚的去除率。
(四)菌胶团形成能力试验
1.将已选得的酚分解能力较强的斜面菌株,分别接种在盛有50mL灭菌的尿素培养基和蛋白胨培养基的容量为250mL的锥形瓶内。

2.28℃摇床上震荡培养12~16h,凡能形成菌胶团的菌株,培养物形成絮状颗粒,静置后沉于瓶底,液体澄清。酚分解能力较强.且又能形成菌胶团的菌株即为入选菌株,经扩大培养后即可提供生产上使用.

五、实验要求

实验内容要求：完成所有实验内容。将所分离到菌株的酚分解能力和形成菌胶团能力列表记录。

实验报告必须包括：①实验目的及原理；②仪器；③方法步骤和结果；④结果讨论。

考核评价：对实验操作情况及实验报告综合评定

实验操作成绩：包括学习态度、实验操作是否正确规范、实验结果是否正确、打扫卫生等方面。

实验报告成绩：包括实验报告的格式是否正确、原理是否论述清楚、实验结果分析讨论是否符合逻辑，报告字迹是否清楚等方面。

六、场地、设备与器材

场地：12幢304.

设备与器材：培养箱、高压蒸汽灭菌锅、摇床、；电炉、三角瓶、试管、培养皿、牛皮纸、纱布、粗棉线、试管塞、pH试纸、载玻片、酒精灯、火柴、吸水纸、滤纸、接种环、记号笔、镊子、试管架、移液管（5mL、1mL、0.1mL）、涂布棒、铜丝篮、比色皿、96孔板、玻璃珠及石英砂等

培养基及药品：牛肉膏蛋白胨培养基、营养肉汤液体培养基、营养肉汤琼脂培养基、尿素培养基、合成培养基、75%酒精、3%碘酒、5%苯酚、200微升移液枪、枪头，生理盐水、等。

《环境工程微生物学》课程实验项目16

选择性实验

一、实验目的

1、培养学生设计实验项目的能力。

2、对整个微生物实验技能进行一次复习、巩固与拓展。

二、实验内容

自选，与微生物相关的实验内容。

三、实验要求

1、每组3～4人，自由组合。

2、每组同学独立完成从实验设计、实验材料的准备到实验的操作、结果观察等各个环节，教师在整个过程仅提供必要的指导和提供所需的原始材料。

四、场地、设备与器材

实验场地：12幢304

设备：显微镜、培养箱、高压蒸汽灭菌锅、摇床、冰箱、分光光度计、超净台、紫外灯、烘箱等。

器材：电炉、三角瓶、试管、牛皮纸、纱布、粗棉线、试管塞、pH试纸、盖玻片、酒精灯、火柴、吸水纸、接种针(环)、记号笔、擦镜纸、镊子等。

药品：牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、PDA培养基等、各类所需药品、蒸馏水等。

菌种：大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。